硝酸鈣對嫁接網(wǎng)紋甜瓜果實糖含量及糖代謝相關(guān)酶活性的影響

李天來 李驥堯 劉軼飛，2

（1沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，設施園藝省部共建教育部重點實驗室，遼寧省設施園藝重點實驗室，遼寧 沈陽 110866；2沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院，農(nóng)業(yè)部東北土壤與環(huán)境重點開放實驗室，遼寧省農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境重點實驗室，遼寧 沈陽 100866）

甜瓜（Cucumis melon L.）被譽為世界十大水果之一，在國內(nèi)外栽培歷史悠久，是近些年發(fā)展較快、經(jīng)濟價值較高的一種作物。厚皮甜瓜嫁接栽培是克服土壤次生鹽漬化、連作障礙、低溫、弱光等環(huán)境傷害和防治土傳病害的重要措施之一。但生產(chǎn)實踐和許多研究證實，嫁接往往導致甜瓜品質(zhì)下降，尤其是嫁接甜瓜果實含糖量明顯降低（許傳強和李天來，2005），而含糖量是衡量厚皮甜瓜品質(zhì)的重要指標之一（Yamaguchi et al.，1977）。因此探討厚皮甜瓜果實糖代謝的調(diào)控措施對于改善嫁接厚皮甜瓜果實品質(zhì)具有重要意義。

前人在蘋果和柑橘等作物研究（梁和 等，2002；耿增超 等，2004）中已證實，產(chǎn)品器官生長發(fā)育期合理施用鈣肥，可以提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)，調(diào)節(jié)以蔗糖為轉(zhuǎn)運糖的植株糖代謝相關(guān)酶活性，提高含糖量，甚至在逆境脅迫條件下也能緩解果實品質(zhì)下降（李彥 等，2003）。還有報道指出，適量的氮肥可以提高果實中可溶性糖含量及糖酸比，但過量施用氮肥不利于產(chǎn)量的提高和糖分的積累（趙智中 等，2001；姜東 等，2002；齊紅巖 等，2005）。然而，有關(guān)以水蘇糖為主要轉(zhuǎn)運糖的植物果實糖含量和糖代謝相關(guān)酶活性的鈣素調(diào)控研究甚少，目前更沒有在生產(chǎn)上應用。

為此，本試驗研究了不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實棉籽糖系列寡糖代謝的影響，旨在為進一步應用硝酸鈣改善嫁接厚皮甜瓜品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2009年2～7月在沈陽農(nóng)業(yè)大學工廠化高效農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心試驗基地進行。供試材料為自根網(wǎng)紋甜瓜（Cucumis melon L.var.reticulatus Naud.）品種中蜜1號和以白籽南瓜圣砧1號為砧木、以中蜜1號為接穗的嫁接厚皮甜瓜。2月20日播種網(wǎng)紋甜瓜中蜜1號，3月1日播種白籽南瓜圣砧 1號。待接穗長到二葉一心時與砧木進行靠接，而后定植于日光溫室栽培桶中，桶高30 cm，直徑30 cm，桶內(nèi)裝腐熟好的基質(zhì)（土∶草炭∶雞糞=3 V∶2 V∶1 V），桶底鋪2 cm厚的珍珠巖，株距60 cm，行距80 cm。每桶栽種1株，定量澆水，統(tǒng)一施肥，以確保水肥一致；栽培過程中采用吊蔓單干整枝方式，在主干第12節(jié)位留瓜，第21節(jié)位去生長點，每株選留1瓜，雌花開放當日上午進行人工授粉，并掛牌標記花期?；ê? d開始向葉面噴施不同濃度硝酸鈣，利用帶有刻度的2 L小型噴霧器進行葉面噴施，每株噴施50 mL硝酸鈣溶液，每隔7 d噴1次，共噴6次，以噴施蒸餾水的嫁接植株為對照1（CK1），以噴施蒸餾水的自根植株為對照2（CK2），以外源噴施不同濃度的硝酸鈣植株為處理，濃度分別為0.2 %（C1）、0.5 %（C2）、0.8 %（C3），每株取樣1次，3次重復，每隔7 d取果實中果肉用于糖含量及糖代謝相關(guān)酶測定，取樣時間為上午9：00。

1.2 項目測定

1.2.1 可溶性糖含量 依據(jù)Madore（1990）和Miao等（2007）的方法并加以改進。將5 g樣品置于試管中，用80 %乙醇提取，80 ℃水浴1 h，反復提取3次，合并提取液，過C18小柱濾除色素，蒸干，1 mL超純水溶解，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進液相（HPLC）測定。測定方法及色譜條件為：Waters 600E高效液相色譜，柱子為 Luna 5U NH2100R column（Phenomenex Separation Products，USA），柱溫35 ℃，2410示差檢測器，流動相比例為70 %乙腈和30 %超純水，流速為 1.4 mL·min-1。糖標樣（SIGMA-ALDRICH Co.，3050 Spruce Spruce Street，St.Louis，Mo63103 USA）為果糖（Product No.31140）、葡萄糖（Product No.G5400）、蔗糖（Product No.84099）、棉籽糖（Product No.R0250）、肌醇半乳糖苷（Product No.79544）、水蘇糖（Product No.S4001），他們的色譜保留時間分別為 4.468、5.225、6.324、12.007、13.196、21.901 min。并用 Waters Millennium軟件對分離圖譜進行控制及數(shù)據(jù)處理。本試驗中的總糖含量指的是以上幾種糖含量的總和。

1.2.2 淀粉含量 采用高氯酸水解法（牛森，1992）測定。

1.2.3 糖代謝相關(guān)酶活性

1.2.3.1 酶的提取 取 1 g冷凍樣品，加少量石英砂和 10 mL Hepes緩沖液（50 μmol·L-1Hepes-NAOH，pH 7.5，1 μmol·L-1MgCl2，2.5 μmol·L-1DTT，10 μmol·L-1VC 和 5 %不溶性的PVPP），冰浴研磨成勻漿，4層紗布過濾，4 ℃條件下12000 g離心20 min，去上清液，留沉淀，用提取緩沖液2～5 mL溶解沉淀，再用稀釋10倍的提取緩沖液（不含PVPP）透析20 h。以上所有操作在0～4 ℃條件下進行。

1.2.3.2 酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶活性測定 0.8 mL反應液（pH 4.8或 pH 7.2的 0.1 mol·L-1Na2HPO4，0.1 mol·L-1檸檬酸鈉，0.1 mol·L-1蔗糖）中加入 0.2 mL 酶液，37 ℃條件下反應 30 min，用3，5-二硝基水楊酸法測定生成的還原糖含量，酶活性單位為μmol·h-1·g-1（FW）。

1.2.3.3 蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性測定 參照於新建（1985）的方法進行測定，酶的活性單位為μmol·h-1·g-1（FW）。本試驗中測定的SS活性為合成方向。

1.2.3.4 堿性α-半乳糖苷酶的提取和測定 參照杜永臣（1998）的方法并加以改進。

試驗中的UDPG、6-磷酸果糖等生化試劑均購自美國Sigma公司。

采用Excel 2007和DPS分析軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實可溶性糖、總糖和淀粉含量的影響

2.1.1 對可溶性糖含量的影響 從圖1可以看出，嫁接厚皮甜瓜顯著降低了果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，但提高了棉籽糖和水蘇糖含量。從果實不同發(fā)育期含糖量來看，果糖、葡萄糖含量隨果實發(fā)育不斷升高，處理35 d時達到峰值，隨后有所下降，而蔗糖含量則直到果實成熟還在不斷升高，果糖、葡萄糖和蔗糖含量最高分別達到25.62、23.44、26.35 mg·g-1；棉籽糖和水蘇糖含量則呈現(xiàn)下降趨勢，肌醇半乳糖含量的變化趨勢為先升高再降低，而且肌醇半乳糖、棉籽糖和水蘇糖含量較低，尤其是棉籽糖含量，最高僅為0.42 mg·g-1。從不同處理對厚皮甜瓜果實中各種糖含量的影響來看，不同濃度硝酸鈣處理均在一定程度上提高了嫁接厚皮甜瓜果實果糖、葡萄糖和蔗糖含量，降低了棉和水蘇糖含量；與CK1相比，從處理后21 d開始，C2和C3處理顯著提高了果糖、葡萄糖和蔗糖含量，且在處理后14～21 d顯著提高了肌醇半乳糖的含量，而自處理后14 d開始不同濃度硝酸鈣處理均降低了棉籽糖和水蘇糖含量，其中C2處理的影響最大，C3處理次之，C1處理最弱；與CK2相比，C2處理并沒有使果糖、葡萄糖和蔗糖含量恢復到自根厚皮甜瓜水平，但C2處理的果實棉籽糖和水蘇糖含量與CK2差異不顯著。

圖1 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實中果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖、

2.1.2 對總糖和淀粉含量的影響 如圖2所示，不同濃度硝酸鈣處理并沒有改變果實中總糖含量的變化趨勢，隨著果實的不斷成熟，總糖含量在處理后7～35 d呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，于35 d達到最大值。與CK1相比，不同濃度硝酸鈣處理均明顯增加了果實中總糖含量，在處理后21～42 d，C2處理顯著提高了總糖含量，C1、C3處理次之；與CK2相比，在處理后21～35 d，C2處理的總糖含量仍然顯著低于自根對照CK2，但果實成熟時（處理后42 d）總糖含量接近于自根對照。

隨著厚皮甜瓜果實發(fā)育，無論是處理還是對照，淀粉含量都呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，到處理后 35 d達到最大值，隨后有所降低。與CK1和CK2相比，C2和C3處理均顯著或極顯著的增加了處理后35～42 d厚皮甜瓜果實淀粉含量。

圖2 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實中總糖和淀粉含量的影響

2.2 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實糖代謝相關(guān)酶活性的影響

2.2.1 對轉(zhuǎn)化酶活性的影響 如圖 3所示，無論是酸性轉(zhuǎn)化酶還是中性轉(zhuǎn)化酶均在果實發(fā)育初期呈現(xiàn)較高水平，之后其活性不斷降低。從不同濃度硝酸鈣處理對酸性轉(zhuǎn)化酶活性的影響來看，與CK1相比，處理后14～35 d，C2處理極顯著增加了酸性轉(zhuǎn)化酶活性，但與CK2差異不顯著；從不同濃度硝酸鈣處理對中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響來看，不同濃度硝酸鈣處理與CK1相比均無顯著差異，但卻與 CK2差異顯著，說明硝酸鈣處理對于中性轉(zhuǎn)化酶活性影響較弱。

圖3 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實中酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

2.2.2 對蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和堿性α-半乳糖苷酶活性的影響 從圖4可以看出，不同濃度硝酸鈣處理并沒有改變蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和堿性α- 半乳糖苷酶活性的變化規(guī)律。隨著果實發(fā)育，蔗糖合成酶的活性呈先降低后升高的趨勢，從不同濃度硝酸鈣處理對厚皮甜瓜蔗糖合成酶活性的影響來看，與 CK1相比，不同濃度硝酸鈣處理對蔗糖合成酶活性影響不顯著，但卻顯著低于CK2。蔗糖磷酸合成酶活性隨著果實的膨大而增加，從不同處理對于該酶活性的影響來看，與 CK1相比，處理后28～42 d，不同濃度硝酸鈣處理均顯著增加了蔗糖磷酸合成酶活性，其中 C2處理與CK1差異極顯著，卻與CK2無顯著差異，說明不同濃度硝酸鈣處理對蔗糖合成酶活性的影響較弱，而對蔗糖磷酸合成酶活性的影響較強。

在果實膨大前期，不同濃度硝酸鈣處理的堿性α-半乳糖苷酶均具有較高的活性，但隨著果實的發(fā)育其活性開始降低，尤其在處理后21～28 d堿性α-半乳糖苷酶活性下降幅度較大。從不同處理對該酶活性的影響來看，與CK1和CK2相比，在處理后14～28 d，不同濃度硝酸鈣處理均顯著或極顯著的增加了堿性α-半乳糖苷酶活性，其余時期差異不顯著，而且處理間差異也不顯著。

圖4 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實中蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和堿性α-半乳糖苷酶活性的影響

3 討論

3.1 嫁接厚皮甜瓜果實中多種可溶性糖及糖代謝相關(guān)酶活性對不同濃度硝酸鈣處理的響應

已有研究表明，一定濃度的鈣處理可以增加厚皮甜瓜果實中總糖含量和淀粉含量（呂雙雙，2009）；同時，氮素營養(yǎng)也與糖的積累及代謝存在一定聯(lián)系，李遠新等（1997）、彭福田等（2002）研究表明，隨著氮素施用量的增加，蘋果和番茄果實還原糖含量提高；姜東等（2002）的試驗表明，在一定范圍內(nèi)提高施氮量可提高小麥蔗糖磷酸合成酶活性，促進光合碳同化產(chǎn)物向蔗糖的轉(zhuǎn)化，促進蔗糖合成；但施氮過多則會使果實含糖量下降（趙智中 等，2003）。本試驗研究了 3種不同濃度硝酸鈣對厚皮甜瓜果實中棉籽糖類寡糖含量的影響，結(jié)果表明：硝酸鈣對糖含量及其代謝相關(guān)酶均有重要的調(diào)控作用，與CK1相比，在整個果實發(fā)育過程中，0.5 %硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實含糖量的影響最大，顯著提高了果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖、總糖和淀粉含量，并且顯著或極顯著提高了酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶和堿性α- 半乳糖苷酶活性，促進了以棉籽糖和水蘇糖為主要轉(zhuǎn)運形式的光合產(chǎn)物向蔗糖進而向單糖方向的轉(zhuǎn)化，使成熟果實中總糖含量和淀粉含量增加，0.8 %硝酸鈣處理提高嫁接厚皮甜瓜果實含糖量的程度不及0.5 %硝酸鈣處理，這可能是由于氮水平過高，超出了正調(diào)控的范圍，從而使硝酸鈣的調(diào)控效果減弱。因此，本試驗條件下，0.5 %硝酸鈣溶液為最佳處理濃度。

3.2 硝酸鈣處理條件下嫁接厚皮甜瓜果實糖代謝相關(guān)酶活性與可溶性糖含量的關(guān)系

探討嫁接厚皮甜瓜果實糖代謝相關(guān)酶活性與果實中多種可溶性糖含量關(guān)系對于進一步深入研究硝酸鈣處理后糖代謝的作用機制是至關(guān)重要的。根據(jù)前人對葫蘆科作物碳水化合物的代謝路徑的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖代謝對于最終碳水化合物積累貢獻較大，蔗糖代謝相關(guān)酶起著很大的作用（Gao et al.，1999；Dai et al.，2006；Liu et al.，2010）。同時，另外一個關(guān)鍵因素也不容忽視：作為果實棉籽糖類寡糖的起始酶，堿性α-半乳糖苷酶也具有同等重要的作用，報道發(fā)現(xiàn)堿性α-半乳糖苷酶主要負責催化棉籽糖和水蘇糖水解，這對于葫蘆科作物碳水化合物分配和大量轉(zhuǎn)運糖小分子化過程有著重大的貢獻（Tian et al.，2009；Liu et al.，2010）。本試驗發(fā)現(xiàn)在果實發(fā)育前中期，硝酸鈣處理提高了酸性轉(zhuǎn)化酶活性，這為早期厚皮甜瓜果實合成葡萄糖和果糖提供了有利條件。這與前人在蜜桔上的研究結(jié)果相似（趙智中 等，2001）。在果實發(fā)育后期，硝酸鈣處理的蔗糖磷酸合成酶升高較快，同時轉(zhuǎn)化酶活性較低，此時有利于蔗糖的大量積累。以往的研究表明，堿性α- 半乳糖苷酶的活性隨著植物的生長發(fā)育而改變，在南瓜和黃瓜生長前期葉片中的堿性α- 半乳糖苷酶的活性較高，但是隨著庫活力的減弱，其活性減弱（Gaudreault &Webb，1982），這與本試驗中堿性α- 半乳糖苷酶活性的變化趨勢相同。在本試驗中，處理后7～28 d堿性α-半乳糖苷酶的活性較高，這為大量蔗糖及半乳糖的生產(chǎn)提供了保障，有利于向快速膨大的果實提供葡萄糖和果糖。在研究糖積累機理時，應考慮蔗糖代謝相關(guān)酶的綜合作用，酶的凈活性是反映這種綜合作用的指標（凌霄 等，2005）?？梢姡跛徕}處理后果實中糖的積累主要受果實內(nèi)部蔗糖代謝酶的種類和活性大小影響。

3.3 不同濃度硝酸鈣處理對嫁接厚皮甜瓜果實品質(zhì)的影響

果實積累糖的種類、含量和比率是決定果實風味品質(zhì)和商品價值的重要因子。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果實中主要的可溶性糖，其含量和組成對果實品質(zhì)起著重要作用，因此碳水化合物的代謝及其變化與果實品質(zhì)形成密切相關(guān)。0.5 %硝酸鈣處理對甜瓜果實中蔗糖代謝和水蘇糖代謝影響顯著。各種糖含量明顯上升，尤其是葡萄糖、果糖和蔗糖，但其調(diào)控程度仍然沒有達到自根對照水平。根據(jù)甜味指數(shù)絕對值公式（馬克奇）：甜味指數(shù)=蔗糖×100+果糖×173.3＋葡萄糖×74.3，計算得出0.5 %硝酸鈣處理后厚皮甜瓜果實、嫁接對照果實及自根對照果實的甜味指數(shù)絕對值分別為7760.23、6492.31、8762.14，0.5 %硝酸鈣處理較嫁接對照果實上升了19.53 %。但是甜度仍然弱于自根對照果實，同時，硝酸鈣處理促進可溶性糖向淀粉方向的合成，使淀粉含量大幅度升高，這在一定程度上降低了果實的甜味，對果實品質(zhì)造成了一定負面影響。因此，如何調(diào)控淀粉向蔗糖方向轉(zhuǎn)化成為今后改善嫁接厚皮甜瓜品質(zhì)的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

與嫁接對照相比，不同濃度硝酸鈣處理均不同程度提高了嫁接厚皮甜瓜果實淀粉、總糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量及其果實發(fā)育前中期的酸性轉(zhuǎn)化酶、堿性α- 半乳糖苷酶和果實發(fā)育中后期的蔗糖磷酸合成酶等糖代謝相關(guān)酶活性，其中0.5 %硝酸鈣處理效果最佳，增加了果實發(fā)育中后期蔗糖含量，具有改善嫁接厚皮甜瓜果實品質(zhì)的作用。但因0.5 %硝酸鈣處理的嫁接厚皮甜瓜果實品質(zhì)仍未能恢復到自根對照水平，因此欲使嫁接厚皮甜瓜果實品質(zhì)恢復到自根水平還需進一步研究。

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