在體微透析結(jié)合HPLC測定小鼠紋狀體細胞外尿嘧啶含量

王天琳，吳春福

尿嘧啶是RNA特有的堿基，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，除參與核苷酸的從頭合成通路外，還可作為嘧啶核苷酸補救合成通路的基質(zhì)，也是磷酸卵磷脂(PC)和腦磷脂(PE)合成通路中的重要物質(zhì)［1-2］。近年來，其功能的多元化越發(fā)引起人們的注意，尿嘧啶含量的檢測也逐漸成為人們關(guān)注的焦點［3］，但檢測動物腦脊液中尿嘧啶的方法鮮有報道。因此，本文利用在體微透析技術(shù)結(jié)合高效液相色譜(HPLC)，建立了檢測腦脊液中尿嘧啶含量的方法，為中樞系統(tǒng)研究中尿嘧啶含量的檢測提供一種有效、可靠、重復(fù)性好的方法。

1 材料

1.1 儀器 島津LC10AT型恒流泵，SPD10AVP紫外檢測器，L2000色譜工作站;VertiSep GES-C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，馬來西亞);小鼠腦立體定位儀(第二軍醫(yī)大學(xué)江灣-1型C);307-2B型牙科臺式電鉆車(寧波醫(yī)療器械廠);ZSB-1A自動注射泵(航空航天部北京星達技術(shù)開發(fā)公司);透析管(分子量50 000 EICOM，日本)。

1.2 試劑與藥品 Uracil標準品(Sigma，美國)，Uridine標準品(Sigma，美國);乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，磷酸二氫鈉(分析純，沈陽市試劑三廠)，磷酸(分析純，沈陽化學(xué)試劑廠)，Ringer's液(自制)，冰塊(自制)。所有溶液均用去離子水配制。

1.3 實驗動物 雄性昆明種小鼠［動物合格證號:SCXK(遼)2008-2010］，體質(zhì)量18 ～22 g，購于沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心，動物飼養(yǎng)在室溫環(huán)境下，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱:VertiSep GES C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:乙腈 － 0.02 mol/L磷酸二氫鈉(2∶98)，磷酸調(diào)pH值為3～4;檢測波長:260 nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:0～5℃;進樣量20 μL;理論塔板數(shù)不低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液的配制 精密稱取Uracil和Uridine 溶于 Ringer's(147 mM NaCl，2.2 mM CaCl2，4 mM KCl)液［4］中，制得 Uracil和 Uridine濃度均為1.0 μg/mL的標準溶液，渦旋溶解，于4℃冰箱中保存，使用前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

2.2.2 透析樣品溶液的制備 小鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，固定于腦立體定位儀上。切開頭部皮膚，暴露顱骨，于前囟水平向前0.5 mm，水平向下3.5 mm，左右兩側(cè)各鉆一孔，將透析管植入腦內(nèi)。在透析管兩端距有效透析部位10 mm處，分別粘上一段長15 mm、外徑0.7 mm的不銹鋼管，用牙科水泥固定于顱骨表面，小鼠蘇醒恢復(fù)正常后18～24 h進行灌流。調(diào)節(jié)灌流速度為10 μL/min。棄去前30 min的流出平衡液，以后每10 min收集1個樣品，即刻進樣。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 在上述色譜條件下，分別以Ringer's液、標準品溶液和透析樣品溶液進樣，Uracil的保留時間約為4.5 min，其在標準品溶液和透析樣品溶液中保留時間一致。灌流液所形成的溶劑峰不干擾其測定，且與腦內(nèi)其他物質(zhì)分離良好。色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖

3.2 精密度實驗 吸取同一標準品溶液20 μL，重復(fù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果Uracil=(6 954± 481)，RSD=0.55，n=5，提示儀器精密度良好。3.3 標準曲線的制備 將標準品溶液稀釋，分別制得濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的標準溶液，測定峰面積，以峰面積Y對其濃度X進行線性回歸。制得歸一化法標準曲線。U-racil:Y=32 938 X+506.83(R2=0.998 4)。說明尿嘧啶在0.05～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 體外回收率試驗 經(jīng)體外回收率校正，每15 min測得小鼠正常清醒自由活動狀態(tài)下紋狀體細胞外液Uracil基礎(chǔ)水平為(177±65)ng(n=30)。連續(xù)檢測2 h尿嘧啶水平基本穩(wěn)定。尿嘧啶體外回收率為8.4%。

3.5 加樣回收率 連續(xù)透析20 min獲取40 μL透析液，吸取20 μL 測定 Uracil含量，另取15 μL的透析液，精密加入Uracil標準品溶液5 μL后進樣，結(jié)果Uracil的加樣回收率為92.1%(RSD=1.52，n=5)。

3.6 穩(wěn)定性試驗 將存有Uracil樣品的透析樣品放置 －80 ℃冰箱保存，于 0、0.5、1、2、4周時取出測定，37℃水浴溶解后迅速進樣3次，考察Uracil凍存穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Uracil透析樣品在－80℃保存4周穩(wěn)定。

4 討論

腦內(nèi)微透析技術(shù)是近20年在國際上發(fā)展起來的一種新的生物體內(nèi)微量取樣技術(shù)，其優(yōu)點是可以于清醒狀態(tài)下，對動物腦中各種遞質(zhì)和其他小分子物質(zhì)進行連續(xù)取樣，從而更真實、直接地反映出藥物或其他因素的作用或影響［5］。由于透析樣品不含大分子物質(zhì)，所以可直接應(yīng)用HPLC對其進行分析測定。

在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，都存在著神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)水平的變化，如谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、抗壞血酸(AA)等。近年來，除經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)外，核酸與核苷酸的作用受到越來越多的關(guān)注，而尿嘧啶作為腦內(nèi)主要嘧啶核苷酸之一，在藥物成癮、神經(jīng)元損傷中的作用已成為近年來研究的焦點。

由于生物樣品中物質(zhì)種類較多，特別是核苷酸分子存在結(jié)構(gòu)相近、最大紫外吸收波長相鄰等特點，待測指標的完全分離顯得較為困難。本文根據(jù)Uracil的水溶性特點，調(diào)整流動相配比，減少了有機相，并用磷酸調(diào)整pH值，增加極性;降低柱溫、流速，以延長保留時間，以上操作在保證檢測限的同時，大大提高了分離度，使Uracil得以較好分離。

綜上所述，在體微透析結(jié)合HPLC紫外檢測器可方便快捷地檢測腦透析液中Uracil含量，具有簡便、快速、準確度好、靈敏度高等特點，為進一步開展中樞系統(tǒng)研究中核苷酸的檢測提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

［1］ Cansev M.Uridine and cytidine in the brain:their transport and utilization［J］.Brain Res，2006，52(2):389-397.

［2］ Sprong H，Degroote S，Nilsson T，et al.Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum［J］.Mol Biol Cell，2003，14(8):3482-3493.

［3］ 蔡樂，葉敏，付強，等.HPLC法測定血漿中尿嘧啶和二氫尿嘧啶的含量［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2008，5(6):10-13.

［4］ Wang TL，Wu CF，Yang JY，et al.Effect of morphine on brain uracil release in mouse striatum detected by microdialysis［J］.Neurosci Lett，2009，457(2):89-92.

［5］ 魏宇寧，張盈盈.腦微透析技術(shù)在腦內(nèi)研究中的應(yīng)用［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2010，7(2):120-123.