5-Aza-CdR與低濃度CDDP聯(lián)合用藥對胃癌細(xì)胞系生長及DAPK1的影響

王賀玲，張 健，李 巖，王學(xué)清

順鉑(CDDP)作為治療多種實體瘤的臨床一線用藥，是胃癌的常用化療藥物。其作用類似烷化劑，主要通過特異結(jié)合DNA，使鏈內(nèi)及鏈間發(fā)生交鏈，干擾DNA復(fù)制、RNA及蛋白質(zhì)的合成［1-5］。5-Aza-CdR是明確的去甲基化藥物，能與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物活性，以進一步使基因去甲基化，使失活基因重新表達(dá)。本文通過對低劑量順鉑與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥，觀察兩者對胃癌細(xì)胞生長及DAPK1基因的影響，探討5-Aza-CdR是否能夠作為一線化療藥物順鉑的輔助用藥，使該藥物在較低劑量時發(fā)揮較大的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 BGC823細(xì)胞系購自中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室，5-Aza-CdR及碘化丙啶(PI)為Sigma產(chǎn)品，順鉑(CDDP)為貴州漢方制藥有限公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，RPMI 1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品，Taq酶及dNTP均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CDDP與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥對胃癌細(xì)胞的影響:胃癌BGC823、SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%鏈霉素，青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞生長活性 (1)CDDP對胃癌細(xì)胞的影響:取處理前的對數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔2×103(200 μL)接種于96孔板，共接種5板，每組6孔。接種24 h后去上清液，加入含CDDP(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)放入 CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，以后在24、48、72 h各時間點分別取一板，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇570 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加CDDP干預(yù)的細(xì)胞為對照組。(2)CDDP與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥對胃癌細(xì)胞生長的影響:將胃癌細(xì)胞傳代24 h后，加入含5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液，作用 48 h后，將細(xì)胞按每孔2×103(200 μL)接種于96孔板，共接種5板，每組6孔，接種24 h后去上清液，加入含CDDP按(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，以后在24、48、72、96、120 h 各時間點分別取一板，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇570 nm 波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加5-Aza-CdR干預(yù)的細(xì)胞為對照組。

1.2.3 半定量RT-PCR分析 DAPK1的表達(dá):用Trizol試劑提取各組BGC823細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。DAPK1引物序列上游引物:5'-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3'，下 游 引物:5'-AAGTCCCGTGGCTGGTAGA-3'，擴增長度為172 bp。以 β-actin為內(nèi)參，上游引物:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下 游 引 物:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，擴增長度為498 bp。兩對引物均加入25 μL反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)條件:94℃變性45 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠分離，用Alpha Image 2000自動成像儀攝影，用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件分析RT-PCR產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線 從生長曲線可以看出，SGC7901細(xì)胞與BGC823細(xì)胞在5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的作用下生長受到一定的抑制，而在低濃度的CDDP(1×10－6mmol/L)的作用下生長為接近直線，無明顯的對數(shù)生長期，而在兩種藥物的聯(lián)合作用下，生長曲線出現(xiàn)了下降的趨勢，說明此兩種藥物的聯(lián)合有協(xié)同作用。見圖1、圖2。

圖1 SGC7901細(xì)胞在用藥前后生長曲線

2.2 DAPK1基因的mRNA的表達(dá)情況 細(xì)胞目的基因cDNA與β-actin cDNA光密度比值與對照組的兩者光密度比值進行比較，增高30% ～70%為上調(diào)，減少30% ～70%為下調(diào)。在細(xì)胞中聯(lián)合用藥組亦見明顯的該基因表達(dá)上升(與CDDP組比較)。而用藥后DAPK1基因的表達(dá)均明顯上升，尤其在聯(lián)合用藥組，2株細(xì)胞中該基因表達(dá)均明顯上升(與CDDP組比較)。見表1。

圖2 BGC823細(xì)胞在用藥前后生長曲線

表1 SGC7901細(xì)胞與BGC823細(xì)胞在用藥前后各目的基因的mRNA表達(dá)情況(目的基因光密度/β-actin)(±s)

表1 SGC7901細(xì)胞與BGC823細(xì)胞在用藥前后各目的基因的mRNA表達(dá)情況(目的基因光密度/β-actin)(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與5-Aza-CdR組比較，#P＜0.05;與 CDDP組比較，ΔP＜0.05

SGC7901細(xì)胞 DAPK1 BGC823細(xì)胞DAPK1對照組 0.221±0.024 對照組0.165±0.003 5-Aza-CdR(5×10－6 mol/L)48 h 0.524±0.008*5-Aza-CdR(1×10－6 mol/L)48 h 0.472±0.035*CDDP(5×10－6 mol/L)48 h 0.772±0.011*#CDDP(1×10－6 mol/L)48 h 0.373±0.021*聯(lián)合用藥組48 h 0.812±0.006*#Δ 聯(lián)合用藥組48 h 0.56±0.023*Δ

3 討論

胃癌化學(xué)治療的主要作用機制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡能力的強弱與化療敏感性密切相關(guān)，在化療基礎(chǔ)上輔以促進凋亡的藥物，可顯著提高胃癌的化療敏感性［6］。近年來，許多體內(nèi)外研究表明，5-Aza-CdR與CDDP在腫瘤的治療上具有協(xié)同作用。研究表明，CDDP化療藥物的耐藥機制與該藥物誘導(dǎo)了部分基因的甲基化有關(guān)，而5-Aza-CdR是明確的去甲基化誘導(dǎo)劑，對細(xì)胞的凋亡均有誘導(dǎo)作用［7-8］。在對宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CDDP和5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)聯(lián)合應(yīng)用于ME180人類宮頸鱗狀上皮癌細(xì)胞系和6個單克隆細(xì)胞(在ME180基礎(chǔ)上培養(yǎng)出的具有對CDDP抵抗的次克隆ME180細(xì)胞)，明顯提高了對母系細(xì)胞和對CDDP抵抗的次克隆細(xì)胞對CDDP的敏感性。5-Aza-CdR的應(yīng)用迅速逆轉(zhuǎn)了對CDDP抵抗細(xì)胞已增加的敏感性，而母細(xì)胞對CDDP敏感性的提升至少可保持24 h。相較于母系細(xì)胞，RT-PCR顯示，CDDP抵抗的次克隆表達(dá)較高的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)mRNA水平，DNMT的表達(dá)提升很容易恢復(fù)次克隆細(xì)胞(去除5-Aza-CdR后)對CDDP的抵抗。雖然母細(xì)胞顯示了DAPK啟動子區(qū)域的高甲基化，但在2個CDDP抵抗的次克隆細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的甲基化區(qū)域(MSP)。6株CDDP抵抗的次克隆細(xì)胞DAPK的表達(dá)均比母細(xì)胞高。對CDDP的抵抗伴隨著分子的變化，擾亂DAPK轉(zhuǎn)錄后的翻譯，這些分子變化可由去甲基化而短暫恢復(fù)［9］。在對前列腺癌的研究中，當(dāng)5-Aza-2'-CdR單獨加入DU145中培養(yǎng)時，不能誘導(dǎo)明顯的凋亡。而與CDDP聯(lián)合用藥后，在控制DU145細(xì)胞凋亡壞死中表現(xiàn)了強大的協(xié)同作用［10］。CDDP是神經(jīng)細(xì)胞瘤的主要化療藥物。近年研究表明，在此進程中，藥物誘導(dǎo)的DNA甲基化扮演重要角色，而5-Aza-2'-CdR能恢復(fù)其對CDDP的敏感性［11］。在胰腺癌腫瘤發(fā)生的過程中，甲基化狀態(tài)的改變已經(jīng)被認(rèn)為是一種可能的表觀遺傳學(xué)改變。由于對傳統(tǒng)藥物治療抵抗的腫瘤預(yù)后較差，在用甲基酶抑制劑5-Aza-CdR對不同胰腺癌細(xì)胞系處理后，發(fā)現(xiàn)基因廣泛的去甲基化誘導(dǎo)使其對各種化療藥物的敏感性增加［12］;而5-Aza-CdR亦能夠提高精母細(xì)胞瘤細(xì)胞系對CDDP的敏感性［13］。

本實驗研究了低濃度CDDP(1×10－6mol/L)對胃癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)其僅對胃癌細(xì)胞生長有抑制作用，與5-Aza-CdR共同作用于胃癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡較單獨CDDP作用時明顯升高，表明5-Aza-CdR能夠增加胃癌細(xì)胞對低濃度CDDP的敏感性。

腫瘤細(xì)胞凋亡受眾多凋亡相關(guān)基因調(diào)控，DAPK1基因即死亡相關(guān)蛋白激酶-1(Death-associated protein kinase-1)也是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的正調(diào)控因子。研究表明，DAPK1作為一種細(xì)胞凋亡的正性調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)低下或缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān);檢測DAPK1蛋白可以作為判斷胃癌細(xì)胞的分化程度及腫瘤類型的新的分子生物學(xué)指標(biāo)，為臨床診斷、治療提供新的靶點［14-16］。許多研究亦證實，該基因在胃癌中的高甲基化狀態(tài)與該基因的表達(dá)下降有明顯的關(guān)系［17］。在聯(lián)用5-Aza-CdR與5-FU、PTX、OXA等藥物的體外實驗中亦發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性提高與DAPK表達(dá)有關(guān)［18］。從本實驗結(jié)果亦可以看出，在胃癌細(xì)胞中，DAPK基因在5-Aza-CdR增加CDDP藥敏性方面起到重要作用。考慮此兩種藥物的協(xié)同作用與細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)增加有關(guān)，兩種藥物與目的基因去甲基化，使其表達(dá)逆轉(zhuǎn)，從而進一步增加CDDP對腫瘤細(xì)胞的作用。

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