三氧化二砷抑制重組白細(xì)胞介素13促成纖維細(xì)胞膠原的表達(dá)

肖 莉，王 煜，張凌志，李振華

肺纖維化已知病因包括過敏原、化學(xué)藥品、輻射以及粉塵。然而最常見的肺纖維化—特發(fā)性肺纖維化(IPF)的病因仍然不清，尚無特效治療藥物。目前認(rèn)為，慢性炎癥導(dǎo)致趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子分泌失衡，尤其是當(dāng)白細(xì)胞介素13大量分泌時(shí)，引起機(jī)體由正常炎癥愈合過程轉(zhuǎn)變?yōu)橹路卫w維化的病理過程［1］。因此，尋求有效藥物逆轉(zhuǎn)白細(xì)胞介素13等致肺纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)引起的內(nèi)環(huán)境紊亂，可能預(yù)防和有效阻止肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

三氧化二砷(Arsenic trioxide，As2O3)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)已取得較好療效［2］。目前研究表明，As2O3不僅抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，同樣對(duì)嗜酸粒細(xì)胞［3］、巨噬細(xì)胞［4-5］以及中性粒細(xì)胞［6］等炎性細(xì)胞的增殖具有抑制作用。筆者在先期試驗(yàn)中，證實(shí)As2O3抑制3T3成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］;IL-13能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分泌炎性介質(zhì)和增強(qiáng)Ⅰ型膠原的表達(dá)［8］。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察 As2O3對(duì)IL-13促成纖維細(xì)胞增殖及分泌膠原是否有抑制效應(yīng)，為治療肺纖維化尋求新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞及試劑:NIH3T3細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室提供。0.1%As2O3注射液由哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)提供。四甲基偶氮唑蘭(MTT)由Sigma公司提供(PBS稀釋成12 mmol/L過濾除菌，4℃避光保存)。兔抗小鼠Ⅰ型膠原一抗購(gòu)自美國(guó)Rocland公司;HRP-羊抗兔IgG(二抗)，武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將NIH3T3細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。試驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、0.2%臺(tái)盼藍(lán)拒染率＞95%的細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/mL，每孔200 μL，加入96孔板中，37℃(5%體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，分別加入80 ng/mL rIL-13+不同干預(yù)濃度的As2O3溶液各 200 μL(As2O3濃度分別為 0、2、4 μmol/L)培 養(yǎng) 24、48 h，其 中 80 ng/mLrIL-13DMEM組作為對(duì)照組。每孔中加入MTT 15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入 DMSO 100 μL，于 490 nm處測(cè)定吸光度值。每組干預(yù)液及對(duì)照組均重復(fù)做5孔對(duì)照。藥物作用效應(yīng)即抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組 3T3成纖維細(xì)胞調(diào)為2×105/mL，種植于培養(yǎng)瓶中(75cm2)。貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別加入DMEM(對(duì)照組)、rIL-13(80 ng/mL)及rIL-13+不同濃度(2 μmol/L和 4 μmol/L)的 As2O3溶液各200 μL，共同孵育細(xì)胞48 h。

1.2.4 Western blot方法檢測(cè)3T3成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參照，收集各組細(xì)胞懸于500 μL冰冷緩沖液，冰浴中將細(xì)胞超聲粉碎，4℃12 000×g/min離心1 h，棄沉淀。吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣本中蛋白濃度。樣品中加入樣品緩沖液，沸水煮5 min。上清(每個(gè)樣品取20 μL)用7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離。BIO-RAD電泳板，雙板條件:150 V，30 mA。轉(zhuǎn)印:硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10 min，然后遵循膠在負(fù)極、膜在正極的原則，經(jīng)2 h 50 V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜3次，每次5 min。封閉:用含5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗孵育:封閉后TTBS洗2次，轉(zhuǎn)至兔抗小鼠Ⅰ型膠原(CoI)單克隆抗體(1∶5 000)4℃過夜，TTBS洗2次(5 min)。二抗孵育:轉(zhuǎn)到HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000)的二抗中，室溫孵育2 h，TTBS洗2次(5 min)，TBS 5 min。檢測(cè):用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，X光片感光。混合A液和B液，按照0.125 mL/cm2的標(biāo)準(zhǔn)。PBS洗后的膜放在混合液中，蛋白面向上，室溫下1 min。暗室中X光片曝光，洗片。

2 結(jié)果

2.1 MTT 結(jié)果表明，As2O3抑制IL-13誘導(dǎo)的3T3細(xì)胞增殖(用細(xì)胞抑制率表示)，且抑制作用呈量效和時(shí)間依賴關(guān)系(P＜0.01)。見表1。

表1 As2O3對(duì)3T3細(xì)胞增殖的抑制作用(%，n=5)

2.2 Western blot法 結(jié)果顯示，DMEM(對(duì)照組)、rIL-13(80 ng/mL)及 rIL-13+不同濃度的As2O3(2 μmol/L 和 4 μmol/L)組成纖維細(xì)胞均可檢測(cè)到Ⅰ型膠原。rIL-13組分泌膠原的量顯著高于對(duì)照組，不同濃度As2O3+rIL-13組的成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)顯著低于rIL-13組。其中，4 μmol/L As2O3+rIL-13 組與2 μmol/L As2O3+rIL-13組相比，細(xì)胞分泌膠原的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 不同組別3T3成纖維細(xì)胞的I型膠原表達(dá)注:A.DMEM對(duì)照組;B.rIL-13;C.rIL-13+As2O32 μmol/L;D.rIL-13+As2O34 μmol/L

3 討論

肺纖維化是多種病因引起的肺異質(zhì)性疾病，主要病理特點(diǎn)是早期彌漫性肺泡炎、后期大量成纖維細(xì)胞病理性增生及細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性集聚并取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致肺功能喪失。目前研究表明，在纖維化的起始階段，Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，Th2占優(yōu)勢(shì)，從而激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。IL-13是一種多效能Th2免疫調(diào)節(jié)因子。在IL-13單獨(dú)被抑制的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，證實(shí)IL-13是組織纖維化的主要致病因子［9］。先期研究結(jié)果表明［10］，IPF患者外周血及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-13水平均較對(duì)照組顯著增高，而且BALF IL-13水平與其用力肺活量(FVC)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、一氧化碳彌散(DLCO)呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，IL-13能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分泌炎性介質(zhì)和增強(qiáng)Ⅰ型膠原的表達(dá)［8］。

As2O3是中藥砒霜的主要成分，作用包括:刺激分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制增殖和抑制血管生成［11］。鑒于As2O3在治療腫瘤方面的療效已得到共識(shí)，人們將研究對(duì)象不斷擴(kuò)展到除腫瘤細(xì)胞以外的人體細(xì)胞。Han等［12］用As2O3干預(yù)不同種細(xì)胞，如子宮頸癌Hela細(xì)胞、牛肺動(dòng)脈上皮細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞等，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、死亡情況。先期試驗(yàn)中，Hochest熒光染色及透射電鏡下可見As2O3作用后的3T3細(xì)胞具有早、中期凋亡形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞漿濃縮及染色質(zhì)邊集、固縮。MTT法證實(shí)，As2O3可顯著抑制成纖維細(xì)胞增殖;使細(xì)胞周期G0/G1期比例增加，G2/M期減少，細(xì)胞阻滯在G0/G1期。本試驗(yàn)結(jié)果表明，As2O3對(duì)IL-13促成纖維細(xì)胞增殖功能表達(dá)有抑制作用，表明As2O3可能部分通過抑制Th2細(xì)胞因子對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖功能而發(fā)揮治療肺纖維化作用。

慢性肺纖維化主要與Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原相關(guān)。有研究顯示［13］，C57BL/6鼠攝取含低劑量As2O3的水5周和8周后，基因芯片檢測(cè)肺組織RNA水平。與對(duì)照組相比，彈性蛋白和膠原基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下降。提示人類低劑量接觸As2O3，可能對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。同樣，本實(shí)驗(yàn)表明，As2O3對(duì)IL-13促成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)有抑制作用，說明在肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展階段，As2O3可能通過拮抗Th2細(xì)胞因子對(duì)成纖維細(xì)胞分泌膠原的功能而發(fā)揮治療肺纖維化的作用，但作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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