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    H5N1亞型禽流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

    2011-05-21 09:41:56崔佳瑩張文亮鄧國華陳化蘭
    關(guān)鍵詞:雜交瘤周齡細(xì)胞株

    崔佳瑩,李 印,于 揚(yáng),張文亮,鄧國華,陳化蘭

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150001)

    禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類的感染和(或)疾病綜合征,根據(jù)AIV致病力分為非致病性禽流感病毒(NPAIV),低致病性禽流感病毒(LPAIV)和高致病性禽流感病毒(HPAIV)3種[1]。H5N1亞型病毒株屬于HPAIV,其對養(yǎng)禽業(yè)的危害使得該亞型AIV的快速診斷成為研究熱點(diǎn)[2-4]。

    血凝素(Hemagglutinin,HA)為AIV的表面糖蛋白(75 ku),是構(gòu)成AIV囊膜纖突的主要成分之一,直接參與了AIV的致病過程[5],編碼HA的基因發(fā)生點(diǎn)突變引起抗原漂移是病毒HA發(fā)生抗原變異的主要原因之一[6]。本實(shí)驗(yàn)以AIV H5N1GD261作為免疫原,應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了針對其HA蛋白的單克隆抗體(MAb),對快速檢測具有該抗原類型的AIV有著重要的應(yīng)用價值[7]。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 AIV H5N1GD261分離株、骨髓瘤SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;4周齡~6周齡及6周齡~10周齡清潔級BALB/c雌鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基和PEG(MW1500)融合試劑、秋水仙素、滅活劑β-丙內(nèi)酯、篩選劑8-AG均購自Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;鼠源MAb亞類鑒定試劑盒、HRP和FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Southern Biotech公司;底物OPD購自Seebio Biote-chnology公司。

    1.2 MAb的制備與鑒定

    1.2.1 動物免疫及MAb的制備 以H5N1GD261為免疫原,將病毒濃縮滅活后與弗氏完全佐劑等體積乳化,免疫6周齡~8周齡BALB/c小鼠,在首免后第15 d和30 d用弗氏不完全佐劑乳化的病毒加強(qiáng)免疫,細(xì)胞融合前3 d腹腔注射加強(qiáng)免疫。無菌取免疫小鼠脾臟,常規(guī)方法細(xì)胞融合,在融合后第3 d和第7 d分別對融合細(xì)胞進(jìn)行半量換液。

    1.2.2 MAb檢測方法的建立 融合后第10 d,以4 u的病毒作檢測抗原包被ELISA板,取融合細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測,并以SP2/0培養(yǎng)上清和免疫小鼠陽性血清分別做陰陽性對照,初步建立篩選MAb的間接ELISA方法。判定標(biāo)準(zhǔn)為陽性血清的OD490nm值1.0左右,P/N最大。

    1.2.3 制備腹水 按照常規(guī)方法制備腹水。

    1.3 MAb的鑒定

    1.3.1 雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定 采用秋水仙素法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體鑒定。

    1.3.2 MAb亞類鑒定 按照Sigma公司鼠源MAb亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測 對凍存的雜交瘤細(xì)胞株分別在第3月,第6月復(fù)蘇,連續(xù)傳4代并且收集上清液,用間接ELISA檢測培養(yǎng)上清中的抗體效價。用HI方法對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體分泌能力的測定。

    1.3.4 抗體效價測定 以HI實(shí)驗(yàn)測定培養(yǎng)上清和腹水的抗體效價。

    1.3.5 廣譜性檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)上清分別與H5不同病毒株進(jìn)行HI試驗(yàn),檢測MAb的廣譜性。

    1.3.6 HA亞型及病毒特異性檢測 取培養(yǎng)上清分別與AIV H1~H15亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株和新城疫病毒(NDV)進(jìn)行HI試驗(yàn)。

    1.3.7 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 將1∶100稀釋的免疫原病毒H5N1GD261接種MDCK細(xì)胞,37℃培養(yǎng)48 h后冷甲醇固定細(xì)胞,以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為一抗,以FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗,同時設(shè)立未感染病毒的MDCK作為陰性對照,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 MAb的制備 陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過4次克隆純化及ELISA和HI篩選得到3株MAb,分別命名為1A4,2F5和3D3。

    2.2 MAb細(xì)胞株染色體鑒定 各MAb細(xì)胞株染色體數(shù)分別為101、108和110,該數(shù)值接近脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目之和,表明3株雜交瘤細(xì)胞為脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞。

    2.3 MAb抗體亞類的鑒定 鑒定結(jié)果表明2F5為IgM類,其余2株均為IgG2a亞類,輕鏈均為κ鏈。

    2.4 血凝抑制價結(jié)果 3株MAb腹水血凝抑制價分別為212、212和211,培養(yǎng)上清液的血凝抑制價分別為 29、28和 29。

    2.5 廣譜性檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別與近2年流行病學(xué)調(diào)查所采集的12株H5亞型AIV進(jìn)行HI試驗(yàn),結(jié)果表明所制備的MAb能夠與大部分的病毒株產(chǎn)生良好反應(yīng),具有與H5亞型較好的廣譜性(表 1)。

    表1 MAb的廣譜性檢測結(jié)果Table 1 Broad spectrum of MAbs by HI test

    2.6 HA亞型及病毒特異性檢測 用研制的MAb與15株亞型AIV及NDV病毒進(jìn)行HI檢測,結(jié)果表明所制備MAb與AIV其他亞型及NDV無交叉反應(yīng),表現(xiàn)出良好的特異性。

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 3株雜交瘤細(xì)胞株分別在凍存后的第3個月、第6個月復(fù)蘇培養(yǎng),經(jīng)過連續(xù)多次傳代后檢測細(xì)胞株分泌抗體的能力,用HI方法檢測培養(yǎng)液上清,HI血凝抑制價分別由29、211和211下降為26、27和27。結(jié)果表明,雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的能力有所下降,但并未消失,穩(wěn)定性良好。

    2.8 IFA結(jié)果 所獲3株MAb均與感染了相應(yīng)H5亞型AIV的MDCK發(fā)生特異性結(jié)合,熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光,未感染病毒的MDCK細(xì)胞未見綠色熒光(圖1)。

    圖1 MAb與感染H5亞型AIV MDCK的IFA試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Identification of the MAb against H5 subtype AIV in MDCK by IFA

    MAb以其特異性高、敏感性強(qiáng)被廣泛用于各類疾病病原的血清學(xué)檢測和診斷中,使用針對H5亞型HA蛋白的MAb進(jìn)行HI試驗(yàn),可以大大提高檢測的特異性和敏感性;同時用一系列的MAb可以對研究病毒的抗原性進(jìn)行分析和歸類,為研究病毒抗原性變異規(guī)律和研究病毒HA結(jié)構(gòu)與功能提供物質(zhì)條件。本實(shí)驗(yàn)制備的MAb通過與近年分離的AIV H5亞型病毒株進(jìn)行HI試驗(yàn)分析,結(jié)果表明絕大部分新近分離株與這些MAb具有良好反應(yīng),而與以往經(jīng)典病毒流行株標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)性相對較差,表現(xiàn)出病毒一定的差異性。這些MAb的制備為開展H5亞型AIV抗原性差異研究、病毒抗原結(jié)構(gòu)分析和完善病原學(xué)診斷研究等方面提供重要的物質(zhì)條件。

    [1]葛葉,鄧國華,李雪平,等.流感病毒聚合酶PB1-1蛋白的表達(dá)與單克隆抗體的制備[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2009,9(31):726-729.

    [2]Reperant L A,Rimmelzwaan G F,Kuiken T.Avian influenza viruses in mammals[J].Rev Sci Tech,2009.28(1):137-159.

    [3]于康震,陳化蘭,唐秀英.97香港禽流感[J].中國畜禽傳染病.1998,20(3):187-191.

    [4]Abraham A,Sivanandan V,Karunakaran D,et al.Comparative serological evaluation of avian influenza vaccine in Turkeys[J].Avian Dis,1988,32(4):659-662.

    [5]邵紅霞,秦愛建,錢琨,等.抗禽流感病毒H5亞型血凝素特異性單克隆抗體的研制[J].中國動物檢疫,2002,19(8):21-23.

    [6]Gao Yu-mei,Zhang Ying,Shinya K,et al,Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host[J].PLoS Pathog,2009,5(12):1000709.

    [7]Nakagawa N,Maeda A,Kase T,et al.Rapid detection and identification of two lineages of influenza B strains with monoclonal antibody[J].J Virol Methods,1999,79:113-120.

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