體外人工腸液激活與未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴差異蛋白質(zhì)組學(xué)比較

王 哲，王 丹，李 巍，蔡亞楠，楊桂連，趙 權(quán)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

豬帶絳蟲(Taenia solium)是常見(jiàn)的人獸共患寄生蟲，人既是終末宿主又是中間宿主，可引起豬帶絳蟲或人的囊尾蚴病(囊蟲病)。該病在我國(guó)北部和西部地區(qū)流行較廣，給畜牧業(yè)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失，并影響公共健康[1]。未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴經(jīng)人腸液激活后變?yōu)橛懈腥玖Φ牧^蚴，可導(dǎo)致囊蟲病和絳蟲病，未激活的蟲卵由胚膜、內(nèi)胞質(zhì)層、六鉤蚴膜和六鉤蚴等幾部分組成，而六鉤蚴的膜結(jié)構(gòu)僅六鉤蚴膜一層[2-3]，激活后蟲體部分蛋白為適應(yīng)新環(huán)境可能發(fā)生變化，其基因表達(dá)會(huì)因?yàn)樗拗鳝h(huán)境的刺激而有所改變，某些致病性也可能只在宿主的體內(nèi)才會(huì)表現(xiàn)。有的蛋白質(zhì)被腸液消化，而有些為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生新的蛋白，比如熱休克蛋白等。從寄生蟲感染前后宿主蛋白質(zhì)組的變化來(lái)研究?jī)烧叩南嗷プ饔?，直接發(fā)現(xiàn)蛋白水平的變化，更有可能找到與病原體致病性直接相關(guān)的標(biāo)記物或在感染過(guò)程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子。研究表明，激活的六鉤蚴蛋白質(zhì)組含7類總計(jì)65種蛋白質(zhì)[4-6]。差異蛋白質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)熱休克蛋白，免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)和抗氧化系統(tǒng)的蛋白等的表達(dá)開(kāi)啟了正常的細(xì)胞活性向細(xì)胞保護(hù)功能的轉(zhuǎn)變。差異蛋白質(zhì)組研究在血吸蟲和果蠅等侵入宿主機(jī)制的研究中已有應(yīng)用，但至今還未見(jiàn)二維液相色譜分離法應(yīng)用于豬帶絳蟲與宿主相互作用研究的報(bào)道。

ProteomeLabTMPF-2D平臺(tái)的二維液相色譜技術(shù)(Two-dimensionalliquid chromatography separation，2D LC)以高效液相色譜為基礎(chǔ)，利用一維色譜聚焦和二維反相色譜分離對(duì)生物組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離分析。2D LC技術(shù)與雙向聚丙酰胺電泳(2D-PAGE)相比，具有操控簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)，可通過(guò)不同分離模式的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中分子大小差別較大的蛋白、低含量的蛋白以及疏水蛋白的分析[4-5]。本研究應(yīng)用2D LC技術(shù)，對(duì)體外模擬腸道內(nèi)的激活過(guò)程和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴蛋白質(zhì)組進(jìn)行差異分析，確定激活前后豬帶絳蟲六鉤蚴的差異蛋白及蛋白水平的變化，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)確定氨基酸序列為研究豬帶絳蟲的寄生機(jī)制提供方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 二維液相色譜儀Proteme-LabTMPF-2D、ProtemeLabTMPF-2D試劑盒均為Beckman Coulter公司產(chǎn)品[包括高效色譜聚焦柱(HPCF-1D)、無(wú)孔硅膠反相色譜柱(HPRP-2D)、起始緩沖液(Start buffer，SB)、洗脫緩沖液(Eluent buffer，EB)、PD10 G-25脫鹽柱]；PBS緩沖液次氯酸鈉和硫代硫酸鈉購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Percoll液購(gòu)自Sigma公司；新鮮豬膽汁購(gòu)于長(zhǎng)春市南關(guān)區(qū)長(zhǎng)樂(lè)綜合屠宰場(chǎng)；BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自百奧公司。

1.2 豬帶絳蟲六鉤蚴的孵化激活 成熟的豬帶絳蟲收集于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院患者，收集的蟲卵經(jīng)漂洗，加入0.75%次氯酸鈉作用5 min(鏡檢大多數(shù)蟲卵破殼)，加入0.2 mol/L硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，沉淀以PBS和Percoll重懸，4℃，1600 g離心20 min，中間層為純化的六鉤蚴。參照文獻(xiàn)[3]激活純化的六鉤蚴，同時(shí)保留未激活的六鉤蚴。

1.3 激活和未激活六鉤蚴可溶性蛋白提取 在激活和未激活的六鉤蚴中各加入200 μL組織裂解液，4℃20000 g離心90 min，收集上清，應(yīng)用BCA法測(cè)定濾液蛋白濃度，并調(diào)整濃度至3.75mg/mL。

1.4 一維色譜聚焦 一維色譜聚焦分離采用初始緩沖液平衡HPCF柱130 min，蛋白樣品量為1 mg，初始緩沖液洗脫20 min，洗脫緩沖液洗脫75 min，每間隔0.3個(gè)pH單位收集1份樣品，共收集樣品16份于96孔深孔板內(nèi)。當(dāng)流出液的pH到達(dá)4.0±0.1時(shí)，依次用10倍柱體積的1 mol/L NaCl和水洗脫HPCF柱。上述過(guò)程由ProteomeLabTMPF-2D的32Karat軟件自動(dòng)控制。收集的樣品供進(jìn)一步的二維色譜分析。

1.5 二維反相高性能液相色譜 溶劑A為0.1%三氟乙酸水溶液，溶劑B為含0.08%三氟乙酸乙腈溶液。以流動(dòng)相A平衡柱子10 min，每個(gè)一維收集樣本進(jìn)樣200 μL，進(jìn)行線性洗脫梯度洗脫，其中洗脫梯度為0～100%B。二維樣品以0.4 min/管收集于96孔深孔板內(nèi)，將分離好的樣品置于-80℃保存?zhèn)溆茫陨线^(guò)程由32Karat軟件自動(dòng)控制進(jìn)行。

1.6 PF-2D數(shù)據(jù)分析 利用Maping tools軟件將由HPRP產(chǎn)生的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的ASCII格式的文件轉(zhuǎn)換成VUE格式的文件，并轉(zhuǎn)換成模擬膠圖，以分別展示激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴蛋白的表達(dá)譜。

2 結(jié)果

2.1 總蛋白質(zhì)提取結(jié)果 激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴蛋白分別經(jīng)PF-2D一維色譜聚焦分離，各獲得9份不同pH范圍的蛋白質(zhì)組份，將這9個(gè)組份依次進(jìn)行二維反相色譜分析，將得到的色譜數(shù)據(jù)經(jīng)Maping tools軟件處理，獲得的模擬電泳圖結(jié)果表明激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴蛋白在表達(dá)分布主要集中在pH7.71～pH5.31值之間(圖1)。

圖1 PF-2D液相分離的激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴總蛋白Fig.1 Separation of activated and nonactivatedT.soliumoncophere total proteins by PF-2D

2.2 不同pH區(qū)域蛋白質(zhì)分布 從PF-2D分離得到的激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴全部蛋白數(shù)量分布結(jié)果表明，pH值為7.71～5.31的范圍內(nèi)共分離出激活和未激活的豬帶絳蟲六鉤蚴蛋白分別為208個(gè)和197個(gè)。其中，在氨基酸等電點(diǎn)(pI)為7.71～7.41之間的pH值區(qū)段中分離得到的未激活的六鉤蚴蛋白多于激活的六鉤蚴蛋白；在pI為7.41～7.11和6.81～6.51范圍內(nèi)的pH值區(qū)段中兩者蛋白數(shù)量相同，其他pH區(qū)域均為激活的六鉤蚴蛋白數(shù)量多于未激活的六鉤蚴蛋白(表1)。

表1 激活和未激活的六鉤蚴總蛋白的分布圖Table 1 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere total proteins

2.3 不同pH區(qū)域差異蛋白質(zhì)分布 激活和未激活六鉤蚴全部差異蛋白總計(jì)為77個(gè)，其中激活和未激活六鉤蚴分別為44個(gè)和33個(gè)。全部pH值區(qū)段分離結(jié)果顯示，差異蛋白在pI約6.51～6.21和5.61～5.31之間的pH值區(qū)段中，激活和未激活六鉤蚴差異蛋白數(shù)量明顯(表2)。

表2 激活和未激活六鉤蚴差異蛋白分布圖Table 2 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere difference proteins

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究激活和未激活的六鉤蚴蛋白質(zhì)差異，pH值在7.71～5.31的范圍內(nèi)分離獲得相同蛋白164個(gè)，差異總蛋白77，激活的44個(gè)，未激活的33個(gè)，推測(cè)差異蛋白與宿主入寄生蟲的適應(yīng)關(guān)系，結(jié)合質(zhì)譜的鑒定和相應(yīng)的功能研究，從寄生蟲與宿主相互作用的角度研究寄生蟲的毒力因子以及與致病相關(guān)的宿主因子。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門新興學(xué)科，目前以高效液相色譜方法(HPLC)為主的技術(shù)平臺(tái)，特別是與各種質(zhì)譜串聯(lián)的多維色譜分離技術(shù)逐漸克服了傳統(tǒng)固相2D技術(shù)存在的缺陷，二維液相色譜分離法包括液相狀態(tài)下的色譜聚焦(第一維)及無(wú)孔硅膠反相HPLC分離(第二維)。從第二維洗脫的蛋白質(zhì)可用電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-MS)直接檢測(cè)，或用基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)測(cè)定分離蛋白的完整分子量。二維液相色譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組分離技術(shù)的一種重要補(bǔ)充，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛[7]。PF2D比普通2D電泳優(yōu)勢(shì)明顯，已經(jīng)逐步作為分離蛋白質(zhì)的主導(dǎo)地位，具有靈敏度高上樣量大自動(dòng)化高等特點(diǎn)[8]，而二維液相色譜分離系統(tǒng)可在溶液狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)的分離和收集[9]。而且二維色譜分離可直接與質(zhì)譜串聯(lián)。在獲得所有完整蛋白質(zhì)pI/UV同譜的同時(shí)可得到高精確的質(zhì)量圖譜[10]。本研究通過(guò)ProteomeLabTMPF-2D目標(biāo)蛋白快速分離系統(tǒng)來(lái)對(duì)激活和未激活六鉤蚴的差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了初步研究，并得到了差異蛋白質(zhì)組圖譜，為豬帶絳蟲六鉤蚴與宿主關(guān)系的研究提供試驗(yàn)方法。

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