復(fù)方腸泰體外抗大腸癌活性的有效部位篩選

許珍珍，姚 楠（江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京市 210028）

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是包括從盲腸至直腸的整個(gè)腸段的癌腫，是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占西方國家癌癥發(fā)病率的第二位；在中國，大腸癌的發(fā)病率近來有上升的趨勢，在惡性腫瘤中已排在第四位[1]。復(fù)方腸泰是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科的臨床驗(yàn)方，臨床實(shí)踐中顯示出對大腸癌良好的抑制作用。多年治療數(shù)據(jù)顯示，該藥有著穩(wěn)定和可靠的療效，可降低血黏度，提高患者的免疫功能，從而有效地防止大腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存質(zhì)量。

復(fù)方腸泰是根據(jù)大腸癌的病機(jī)特點(diǎn)，依據(jù)健脾活血解毒法配伍而成，主要由薏苡仁、白花蛇舌草、莪術(shù)、人參、黨參、三七等藥組成。其中薏苡仁健脾利水、扶正補(bǔ)益為君藥，白花蛇舌草等清熱解毒、消癰散結(jié)為臣藥，莪術(shù)、三七活血化瘀、消腫止痛共為佐藥，人參、黨參補(bǔ)中益氣、扶正解毒為使藥。

筆者以系統(tǒng)溶劑萃取法提取復(fù)方腸泰的各個(gè)溶劑部位，結(jié)合體外細(xì)胞模型篩選出其抗大腸癌的有效部位，以期為復(fù)方腸泰抗大腸癌物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

cell 150型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Hera公司）；classⅡtype A2型生物安全柜（美國Labconco公司）；Axio observer A型倒置相差顯微鏡（德國Zeiss公司）；Multiskan Spectrum型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；MH-1403型平板振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

各藥材由筆者購買并鑒定為真品；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小牛血清（民海生物工程有限公司）；MTT、胰酶（美國Amresco公司）；二甲亞砜（分析純，天津博迪化工有限公司）；氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司）。

1.3 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）購自中科院上海細(xì)胞所。

2 方法[2～7]

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。即用含10%胎牛血清、100μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞換液時(shí)間為2～3 d，3～5 d傳代，傳代前以0.25%胰蛋白酶消化2～5min。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2 溶液的提取

復(fù)方腸泰處方由人參、薏苡仁、莪術(shù)、白花蛇舌草等中藥材組成。復(fù)方腸泰濃縮液制備方法:薏苡仁、莪術(shù)用85%乙醇回流提取2次，提取液揮發(fā)去乙醇；以上藥渣與其余藥材加水煎煮2次，合并乙醇提取液和煎煮液，濃縮至含生藥2.50 g·mL-1。

將上述復(fù)方腸泰濃縮液分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取物揮去溶劑，分別得到復(fù)方腸泰石油醚部位、復(fù)方腸泰乙酸乙酯部位、復(fù)方腸泰正丁醇部位。用時(shí)分別取復(fù)方腸泰濃縮液和各部位溶解，使樣品液濃度均為含生藥1 g·mL-1。

2.3 復(fù)方腸泰各組藥物及陽性藥的加藥前處理

取復(fù)方腸泰濃縮液、復(fù)方腸泰石油醚部位、復(fù)方腸泰乙酸乙酯部位和復(fù)方腸泰正丁醇部位，加入一定量PBS，超聲30min，10000 r·min-1離心10min，取上清液，PBS稀釋，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃貯藏，備用。陽性對照藥氟尿嘧啶用PBS稀釋為 500μg·mL-1。

2.4 復(fù)方腸泰濃縮液及各部位萃取部分對結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用（MTT法）

取對數(shù)生長期大腸癌細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至5×104個(gè)·mL-1，接種于 96 孔板上，每孔0.1mL。置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)液，加入10μL各組復(fù)方腸泰藥物與90μL RPMI 1640培養(yǎng)液。另設(shè)陰性對照組，加入10μL溶劑與90μL RPMI 1640培養(yǎng)液。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。作用48 h 后，每孔加 MTT 10μL（5mg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng) 4 h ，小心吸去上清，加入DMSO 100μL，輕輕振蕩10min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，測定波長為570 nm，參比波長為690 nm，重復(fù)3次。按下式計(jì)算抑制率:抑制率（%）＝（對照孔A值－給藥孔A值）/對照孔A值×100%。

3 結(jié)果

不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖抑制率分別見表1、表2、表3；不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖抑制的比較見圖1。

表1 不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖抑制率（高劑量）Tab 1 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（high-dose）

表2 不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖抑制率（中劑量）Tab 2 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（medium-dose）

表3 不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖抑制率（低劑量）Tab 3 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（low-dose）

圖1 不同極性部位對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖抑制的比較Fig 1 Inhibition of different polarity parts on generation of SW480 cell

由表1～表3和圖1可知，復(fù)方腸泰濃縮液對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480作用48 h后，2.5、5、10mg·mL-1復(fù)方腸泰濃縮液均能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖，與陰性對照組比較，其抑制率分別為39.90%、74.37%、93.00%，呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系。進(jìn)一步考察了復(fù)方腸泰濃縮液不同萃取部位的抗腫瘤活性，從抑制率看，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位抗腫瘤活性存在差異。正丁醇部位對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率較高，其抑制率分別依次為34.40%、52.50%、93.83%。由此可初步確定復(fù)方腸泰抗腫瘤有效部位為正丁醇部位。

4 討論

本文通過體外試驗(yàn)初步篩選出復(fù)方腸泰抗大腸癌的有效部位，并初步探索了復(fù)方腸泰中活性部位-藥效之間的關(guān)系。在后續(xù)試驗(yàn)中通過研究復(fù)方腸泰正丁醇部位高、中、低劑量組對H22荷瘤小鼠瘤重、免疫器官濕重以及溶血素抗體生成的影響，來驗(yàn)證其對H22荷瘤小鼠免疫功能產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，復(fù)方腸泰在抑制瘤重方面能與化療藥注射用環(huán)磷酰胺構(gòu)成協(xié)同作用；在免疫方面能明顯改善環(huán)磷酰胺化療H22荷瘤小鼠所致臟器萎縮，提高胸腺和脾臟系數(shù)，增強(qiáng)其機(jī)體免疫功能；并且能夠升高H22荷瘤小鼠血清溶血素水平，使環(huán)磷酸胺所致的血清溶血素含量下降有明顯恢復(fù)，提高H22荷瘤小鼠的體液免疫能力。

筆者在以后的研究中，將會建立復(fù)方腸泰活性部位的指紋圖譜，探索復(fù)方腸泰中活性部位-藥效-指紋圖譜之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討其抗大腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)制治療大腸癌中藥新藥工作提供理論依據(jù)。

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