參附注射液對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠中樞神經系統(tǒng)病理學的影響

謝健，閔蘇（1.重慶市急救醫(yī)療中心麻醉科，重慶市 400030；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶市 400016）

參附注射液（Shenfu injection，SFI）主要含人參皂苷和烏頭堿。近年來，大量臨床研究將SFI用于器官、組織缺血再灌注時保護性治療，以達到減輕缺血再灌注損傷的目的，并取得了良好效果[1～4]。本研究擬探討SFI對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障和皮質神經元病理學有無影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

721型分光光度儀（上海濟成分析儀器廠）；水浴箱（上海人和科學儀器有限公司）；TGL-16A型離心機（上海精密儀器儀表公司）；EM FC7型超薄切片機（德國 Leica公司）；Hitachi-7500型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2 試藥

SFI（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號:071108）；水合氯醛（青島匯和化工有限公司，批號:070621）；伊文思藍（EB，美國進口分裝，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠80只，♂，體重200～270 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號:SCXK（渝）200220001）。

2 方法

2.1 復制模型、分組和給藥

實驗分為4組，即空白對照、假手術、模型和SFI組。麻醉前禁食6 h，采用Zea Longa線栓法[5]制備大鼠右側大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）缺血2 h再灌注24h模型。iv給藥。

2.2 指標的測定

2.2.1 血腦屏障病理改變的觀察 于缺血2 h再灌注24h即刻麻醉后開胸，主動脈插管，生理鹽水沖洗血液，待右心房切口流出液無色透明時用2.5%戊二醛固定液進行灌注固定。灌注結束后開顱取腦，取右側頂葉皮質，用雙面刀片修塊成1mm3大小，浸入上述固定液中繼續(xù)固定2 h以上。之后用1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，切片機制成超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察血腦屏障的病理改變（腦毛細血管周圍水腫情況和毛細血管管腔受壓迫情況）和大腦皮質神經元的病理改變。

2.2.2 腦組織EB含量的測定 大鼠缺血2 h再灌注24h即刻進行麻醉，iv 2%EB生理鹽水溶液2mL·kg-1，1 h后加深麻醉，開胸，經左心室向主動脈插管并以生理鹽水灌注沖洗血管內的EB直至右心切口流出液變得澄清透明。斷頭取腦，將左右大腦半球分開，去除皮質表面的蛛網膜、血凝塊及腦室脈絡叢，放入5倍于其體積的甲酰胺中，37℃水浴48 h，離心，取上清液在620 nm波長處測吸光度（OD）值，甲酰胺作空白對照。根據標準曲線計算出EB含量（μg·mL-1），腦組織EB含量為上述值的5倍。

2.2.3 神經功能缺損評分 于缺血2 h和再灌注24h分別進行Longa[5]神經功能缺損評分。0分:無神經功能缺損癥狀；1分:輕度神經功能缺損，提尾懸空時不能伸展左前爪；2分:中度神經功能缺損，行走時向左側轉圈；3分:中度神經功能缺損，行走困難，并向左側傾倒；4分:重度神經功能缺損，不能自發(fā)行走。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 大鼠血腦屏障的病理改變

空白對照、假手術組大鼠大腦皮質毛細血管周圍及管腔未見明顯變化；模型組大鼠大腦皮質毛細血管周圍水腫和毛細血管管腔受壓的改變嚴重；SFI組相應區(qū)域毛細血管周圍水腫和毛細血管管腔受壓程度顯著輕于模型組。各組血腦屏障病理改變見圖1。

3.2 大鼠大腦皮質神經元的病理改變

空白對照、假手術組大鼠大腦皮質神經元未見明顯變化；模型組大鼠大腦皮質神經元腫大，細胞膜連續(xù)性中斷，胞漿腫脹、空泡化，細胞核腫脹、破裂，核基質密度增加，異染色質增加；SFI組大鼠大腦皮質神經元腫脹，細胞膜邊界欠清楚，胞漿腫脹，細胞核腫脹，核膜完整，核基質密度輕度增加，異染色質輕度增加。各組大腦皮質神經元病理改變見圖2。

3.3 大鼠腦組織內EB含量

空白對照、假手術組大鼠腦組織內EB含量顯著低于模型組（P＜0.01），SFI組EB含量顯著低于模型組（P＜0.05）。各組腦組織EB含量見表1。

圖1 各組血腦屏障病理改變（EM，×15000）A.空白對照組；B.假手術組；C.模型組；D.SFI組Fig 1 Changes of the ultrastructure of blood-brain barrier（EM，×15000）A.blank control group；B.sham operation group；C.model group；D.SFI group

3.4 神經功能缺損評分

缺血2 h時，空白對照、假手術組神經功能缺損評分低于模型、SFI組（P＜0.01）。再灌注24h后，空白對照、假手術組評分低于模型、SFI組（P＜0.01），且SFI組顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組再灌注24h評分高于其缺血2 h評分（P＜0.01），SFI組再灌注24h評分與其缺血2 h評分無顯著差異。各組神經功能缺損評分見表2。

4 討論

Zea Longa線栓法[5，6]復制動物MCA缺血模型效果肯定、重復性好、操作簡單、不需特殊器械、無須開顱，可準確控制缺血再灌注時間，MCA缺血及再灌注效果都很好。因此，筆者采用此方法造模。參考之前有關報道，本研究對每只大鼠實行缺血2 h、再灌注24h處理[7～9]。

局灶性腦缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理過程，它引起中樞神經系統(tǒng)發(fā)生病理學上的改變，是神經功能障礙的基礎，與神經功能的恢復和預后密切相關。因此，本研究重點觀察SFI對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障和皮質神經元的病理學變化有無影響。

圖2 各組大腦皮質神經元病理改變（EM，×3000）A.空白對照組；B.假手術組；C.模型組；D.SFI組Fig 2 Changes of the ultrastructure of cortical neuron（EM，×3000）A.blank control group；B.sham operation group；C.model group；D.SFI group

表1 各組腦組織EB含量（，n＝10）Tab 1 EB content in the cerebral tissue（，n＝10）

表1 各組腦組織EB含量（，n＝10）Tab 1 EB content in the cerebral tissue（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

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表2 各組神經功能缺損評分（，n＝15）Tab 2 Neurologic impairment score of each group（，n＝15）

表2 各組神經功能缺損評分（，n＝15）Tab 2 Neurologic impairment score of each group（，n＝15）

與空白對照、假手術組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.blank control，sham operation group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

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本研究結果表明，SFI可減輕局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障和皮質神經元的病理改變，從而減輕相應的功能受損傷程度。雖然缺血再灌注損傷的機制尚未闡明，但目前的研究認為，腦缺血再灌注損傷后，血腦屏障結構破壞與以下因素有關:氧自由基、炎性介質、黏附分子、血小板活化因子、水通道蛋白、基質金屬蛋白酶等；神經細胞損傷與以下因素有關:氧自由基、鈣超載、凋亡相關基因、興奮性氨基酸、線粒體損傷和細胞能量代謝障礙等。而SFI具有以下藥理作用:清除氧自由基，減輕鈣超載，減輕炎癥反應，保護線粒體，降低細胞能量代謝障礙，降低促凋亡基因表達，抑制細胞凋亡。這可能是本研究中SFI減輕局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障和腦皮質神經元病理學改變的原因[10～14]。

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