液體電諧振和血凝抑制試驗檢測禽流感的2種方法的對比

楊會娜,蔡家利

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054)

禽流感(avian influenza,AI)是由正黏病毒科流感病A型流感病毒引起的危及禽類、小型哺乳動物和人類的一種病毒性傳染病。該病的毒型較多,變異性極強,低致病性的毒株能在短期內(nèi)變成高致病性的毒株,從而給養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性災(zāi)難[1-7]。禽流感病毒能與雞紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象,即血凝,但是這種血凝現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制,即常說的血凝抑制實驗(HI)。由于血凝反應(yīng)可被特異性抗體所抑制,抗體與抗原(病毒)結(jié)合后,血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上,因此血凝抑制試驗可以用于鑒定病毒,以及作為適時免疫的輔助手段,能避免免疫失敗、免疫空擋及重復(fù)免疫造成的損失。血凝與血凝抑制試驗是當前最普及的監(jiān)測禽流感抗體的一種方法,它對設(shè)備要求不高,但對操作者的熟練程度要求相當高,不似酶標儀等機器設(shè)備的判斷性具有直觀性和機械性[4]。液體電諧振檢測裝置是把抗原與抗體反應(yīng)的特異性和石英諧振換能器對表面質(zhì)量負載變化的高度敏感性相結(jié)合,通過測定發(fā)生生化反應(yīng)的液體電諧振頻率的變化的一種新型壓電免疫傳感儀。當待測抗原或抗體與待檢測的識別分子相互作用而產(chǎn)生特異結(jié)合時,就會引起晶體表面質(zhì)量產(chǎn)生微小變化,所結(jié)合抗原或抗體的量可以通過壓電晶體質(zhì)量效應(yīng)所引起的頻率變化進行表征,即通過測量抗體和抗原結(jié)合前后壓電晶體的震蕩頻率變化值,可得到敏感膜上結(jié)合抗原或抗體的量[8-10]。本研究對液體電諧振試驗和血凝抑制試驗2種檢測禽流感病毒的方法進行比較試驗,并對試驗結(jié)果進行了分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器:SP312等精度頻率檢測儀(中國南京盛普儀器科技有限公司);液體電諧振傳感儀(重慶理工大學(xué)生物醫(yī)電實驗室);超聲波清潔器(無錫泰迪超聲波有限公司)。

試劑:禽流感H5亞型HI試驗抗原(重慶理工大學(xué)生物制藥實驗室);禽流感H 5亞型陽性血清(重慶市動物疫病預(yù)防與控制中心);無水乙醇(重慶川東化工集團有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 1%雞紅細胞的制備

取雞翅靜脈血若干,加1/5體積的抗凝劑(3.8%檸檬酸三鈉),混勻后,加入等體積0.01 mol/L的pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS),1 500 r/min離心處理后,棄去上清液,再加PBS洗滌3次,最后用PBS稀釋管內(nèi)沉淀物,制成1%懸浮雞紅細胞,儲于4℃冰箱,每周新配。

1.2.2 微量法血凝試驗(HA)檢測AIV抗原效價

按照常規(guī)操作方法,經(jīng)血凝試驗檢測,AIV抗原的效價為1∶27,回歸試驗驗證其正效價檢測的正確性。

1.2.3 血凝抑制試驗

試驗原理:禽流感病毒對雞紅細胞具有凝集作用,這種血凝作用可被特異性抗體所抑制,抗體與病毒結(jié)合后,可使血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上,而使紅細胞沉淀。

采用微量法血凝抑制試驗按常規(guī)操作進行,使用1%的雞紅細胞和4個HA單位的AIV病毒抗原,檢測結(jié)果以HI效價大于或等于24判為陽性。

1.2.4 1%紅細胞和禽流感病毒的液體電諧振試驗

試驗原理:在全液相條件下,液體的內(nèi)在性質(zhì)決定著液體的振蕩頻率。在一定環(huán)境下,當成分不變的液體不發(fā)生任何生物或者化學(xué)反應(yīng)時,同時測量的傳感器不變,則其電諧振頻率是一定的。如果液體性質(zhì)發(fā)生改變,那么其電諧振頻率必定變化。本實驗中檢測的就是抗原和抗體特異結(jié)合和不結(jié)合發(fā)生的諧振頻率的變化[9]。

本實驗所用到的反應(yīng)芯片是一種圓形的指叉形傳感器,如圖1所示,它是由一片直徑為1.5 cm的圓狀片體組成,上面鍍有交叉、對稱且留有縫隙的鍍金極板,基頻為10 MHz。

圖1 指叉形傳感器切面

反應(yīng)芯片的清洗:將超聲波清潔器中加適量去離子水,洗掉使用過的指叉形傳感器極板上的反應(yīng)殘余物,再將其浸泡在盛有無水乙醇的小燒杯中,最后將小燒杯放在超聲波清潔器中,清洗1 min,取出吹干,備用。

試驗過程:

1)將潔凈的反應(yīng)芯片安裝在電諧振儀上,溫度設(shè)為37℃,預(yù)熱5 min。

2)配置AIV抗原反應(yīng)液。計算出含4個血凝單位的AIV抗原濃度,按如下公式進行計算:

抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4

即用190μL的PBS稀釋6μL的AIV抗原,總體積為196μL。

3)打開SP312等精度頻率檢測儀,啟動PC機上系統(tǒng)操作軟件。

4)參照血凝抑制實驗的步驟,在液體電諧振儀上進行檢測,具體如下:吸取20μL已配好的AIV抗原反應(yīng)液放入滅菌EP管中,再加20μL AIV陽性血清于EP管中混勻,等PC機上信號穩(wěn)定后吸取20μL混液滴加在傳感器正中央反應(yīng)孔上,10 min后再加10μL前面已配好的1%雞紅細胞,繼續(xù)跑曲線30 min,停止斷開操作系統(tǒng),保存試驗曲線。

5)立即取出反應(yīng)芯片清洗,步驟如本文1.2.4節(jié)。

6)重復(fù)以上步驟,分別檢測不同體積比例的AIV抗原反應(yīng)液和陽性血清的反應(yīng)曲線。

7)用標準陰性血清做空白對照,重復(fù)上述步驟。

2 試驗結(jié)果

2.1 微量法血凝和血凝抑制試驗檢測AIV的結(jié)果

經(jīng)檢測AIV抗原反應(yīng)液抗原的效價為1∶27,AIV抗體陽性血清的效價為1∶26。

2.2 液體電諧振儀檢測AIV的結(jié)果

經(jīng)檢測得到如下曲線:圖2是AIV抗原反應(yīng)液被陽性血清完全抑制,不再和1%雞紅細胞結(jié)合的反應(yīng)曲線;圖3是AIV抗原反應(yīng)液部分被陽性血清抑制,部分和1%雞紅細胞結(jié)合的反應(yīng)曲線;圖4是陰性對照,即AIV抗原反應(yīng)液被陰性血清抑制,而和1%雞紅細胞結(jié)合的反應(yīng)曲線。

圖4 AIV病毒與標準陰性血清的過程反應(yīng)曲線

3 討論

3.1 液體電諧振儀檢測禽流感和HI試驗方法的檢測符合率

圖2中AIV陽性血清和AIV抗原反應(yīng)液的體積比為1∶1。反應(yīng)的前階段是AIV反應(yīng)液抗原和陽性血清中的抗體相互作用,10 min后加入紅細胞,不再有結(jié)合位點與其起作用,因此10 min后的曲線近乎平行線。

圖3中AIV陽性血清和AIV抗原反應(yīng)液的體積比為1∶63,即陽性血清效價的臨界值。反應(yīng)的前階段AIV抗原和抗體部分結(jié)合,10 min后加入紅細胞,未被抑制的那部分AIV抗原和紅細胞結(jié)合。反應(yīng)液性質(zhì)不同,引起曲線發(fā)生波動。HI方法測得的AIV陽性血清的最高效價相一致。

圖4用陰性血清做空白對照。此反應(yīng)中AIV抗原沒有與其結(jié)合的抗體,所以加入紅細胞后,逐漸與紅細胞結(jié)合,反應(yīng)的曲線近似斜直線,最終趨向平行線。

3.2 兩種試驗方法的相關(guān)性

無論是用HI試驗方法檢測禽流感還是用液體電諧振儀檢測禽流感,都需要事先確定禽流感抗原的效價。二者的試驗方法是一致的,不同之處在于HI的實驗結(jié)果在96孔V型微量血凝反應(yīng)板上顯示,而液體電諧振儀檢測禽流感病毒可以通過PC機直觀的顯示。HI試驗方法比較成熟,但是該方法在結(jié)果判定中人為因素較大,而液體電諧振儀的結(jié)果很直觀地以曲線的形式顯示出來,5μL左右的反應(yīng)液就可以進行檢測,儀器中的反應(yīng)芯片清潔后可重復(fù)使用,另外可多個反應(yīng)空同時檢測多個樣品可同時檢測多個樣品。

4 結(jié)束語

本實驗針對新的檢測禽流感方法做了進一步的研究,將其與目前常用的檢測方法——血凝抑制法進行對比。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的檢測方法比較,液體電諧振儀具有檢測速度快、靈敏、操作簡便、結(jié)果直觀等優(yōu)點,未來可用于AIV的早期快速診斷和或者其他方面疾病的診斷,有一定的社會意義和經(jīng)濟價值。

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