兔肝缺血/再灌注損傷DWI及與肝損傷關(guān)系的研究

郭成偉 沈三弟 劉再毅梁長虹曹希明鄭君惠

肝缺血/再灌注損傷 (ischemia reperfusion injury,I/R)預(yù)防和治療一直是肝臟外科領(lǐng)域中的難點(diǎn),其機(jī)制復(fù)雜,是多因素、多種介質(zhì)共同發(fā)揮作用的病理過程。因此,對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的早期診斷準(zhǔn)確尤為重要[1-3]。磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像 (diffusion weighted imaging,DWI)作為組織形態(tài)與運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的“活體探針”技術(shù)具有簡(jiǎn)單、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn),尤其近年來高場(chǎng)強(qiáng)3.0T的應(yīng)用,其成像速度快、信噪比高等優(yōu)點(diǎn),在腹部臟器逐漸廣泛應(yīng)用[4,5]。本實(shí)驗(yàn)旨在分析肝酶ALT、ALP與ADC值關(guān)系,并結(jié)合病理學(xué)檢查,探討3.0T DWI-ADC作為檢測(cè)I/R指標(biāo)的可行性。

方 法

1.動(dòng)物模型制作及分組

健康成年、雄性新西蘭大白兔18只,體重2.5～3kg,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK 2006-0015)。參照Taha等[6]I/R模型制作方法,術(shù)前禁食12h,耳緣靜脈留置24G留置針,3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(1ml/kg),無菌操作,經(jīng)腹白線進(jìn)腹,切口10cm。將胃向左提取,用濕紗布遮蓋。暴露第一肝門,剪開小網(wǎng)膜囊,于肝尾狀葉上方沿門靜脈與上腔靜脈間隙游離肝左葉入肝血管,采用無創(chuàng)性動(dòng)脈夾結(jié)扎入肝左葉的管道結(jié)構(gòu)(肝左動(dòng)脈、門靜脈左支及肝左膽管),阻斷血供60min后,松開動(dòng)脈夾,肝左葉由暗紅色變?yōu)轷r紅,表示再灌注成功,關(guān)閉腹腔,按照再灌注時(shí)間,分為6h、12hI/R組。假手術(shù)對(duì)照組(sham組):除不夾閉入左肝管道結(jié)構(gòu)外,余操作同模型組。術(shù)后適量補(bǔ)液(5m l/kg·h,氯化鈉葡萄糖平衡液)

2.MRI及DWI檢查

應(yīng)用GE 3.0T Signa Excite掃描儀,8通道正交頭線圈,仰臥位;頭先進(jìn),軸位掃描。用自制腹帶捆綁兔腹部。T2WI:TR/TE3200m s/85ms,矩陣 288×224,層厚4mm,NEX 3.00,FOV 18mm,Phase FOV 0.75。T1WI:TR/TE8.5m s/4ms,翻轉(zhuǎn)角20°,NEX 3.00;FOV 22mm;Phase FOV 1.0,NEX 3.00。EPI-DWI:TR/TE2000m s/49.3m s,矩陣128×128,層厚4mm,NEX:4,b=20s/mm2、50s/mm2、100s/mm2、300s/mm2、600s/mm2,b施加在 X 、Y 、Z 三個(gè)方向上;掃描層數(shù)8～10,掃描時(shí)間32s,NEX 4.00;FOV 20cm×10cm,Phase FOV 0.5。

3.組織學(xué)和生化檢查

實(shí)驗(yàn)兔于MRI檢查結(jié)束時(shí)經(jīng)上腔靜脈抽血,離心取血清,用于測(cè)定ALT、ALP含量。而后,實(shí)驗(yàn)兔立即經(jīng)空氣栓塞法處死,切取肝左葉,用4%多聚甲醛經(jīng)門靜脈沖洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定2h,再放入含有1/1000二乙基焦磷酰胺 (diethyl pyrocarbonate,DEPC)的蒸餾水中過夜。用梯度乙醇脫水后石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色,制作病理標(biāo)本,在光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。

4.圖像后處理

圖像后處理:GE AW 4.3 Func Tool Performance后處理工作站。分析指標(biāo):ADC。感興趣區(qū) (ROI):15～18mm2。ROI采用復(fù)制、黏貼的方法在不同b值圖像,分別置于壞死區(qū)與未發(fā)生明顯壞死的區(qū)域,避開血管、膽管結(jié)構(gòu)及扭曲變形區(qū)域,連續(xù)測(cè)量三個(gè)層面,計(jì)算其平均值。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA),組間均數(shù)差異的比較采用LSD-t法;A LT、A LP與ADC 相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。所有結(jié)果都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.I/R組左肝左MRI影像表現(xiàn)及ADC值測(cè)量

在I/R6h組,T2WI及DWI表現(xiàn)為上多位于肝臟邊緣的不均勻性點(diǎn)片狀稍高信號(hào)。12h組,點(diǎn)片狀高信號(hào)在T2WI、DWI表現(xiàn)更為明顯,范圍增大,部分肝臟組織信號(hào)恢復(fù)正常(圖1,2)。

各I/R組ADC低于sham組,其中在b=20s/mm2、50s/mm2、100s/mm2時(shí) ,6h 組ADC 明顯低于sham 組(P＜0.05),雖 12h組ADC低于sham組,但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在b=300s/mm2、600s/mm2時(shí),6h、12h I/R組與sham組之間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),見表1。

2.A LT、ALP以及與ADC相關(guān)性

各I/R組血清AST、A LT、ALP明顯高于sham組(P ＜0.05)。b=20s/mm2、50s/mm2、100s/mm2時(shí) ,ALT與ADC顯著負(fù)相關(guān) (r=-0.497,P＜0.05;r=-0.623,P＜0.05;r=-0.671,P＜0.01);b=20s/mm2、100s/mm2,ALT與ADC分別呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.578,P＜0.05;r=-0.489,P＜0.05),而b=300s/mm2、600s/mm2時(shí) ,ADC 與 ALT 、ALP 間相關(guān)性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.組織學(xué)檢查

6h I/R組鏡下表現(xiàn)為壞死區(qū)肝竇排列紊亂,出現(xiàn)固縮紅染的凋亡細(xì)胞及大量中性粒細(xì)胞,“殘影結(jié)構(gòu)”出現(xiàn);12h I/R組,肝臟微循環(huán)內(nèi)中性粒細(xì)胞進(jìn)一步聚集,肝實(shí)質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤,細(xì)胞凋亡壞死加重,出現(xiàn)局灶性壞死的征象(圖3,4)。

圖1 6h I/R組在肝臟邊緣表現(xiàn)小片狀高信號(hào)(DWI b=300s/mm2)。圖2 12h I/R組梗死 (DWI高信號(hào),b=300s/mm 2)的范圍明顯擴(kuò)大。

圖3 6h I/R鏡下表現(xiàn)為肝細(xì)胞明顯腫脹,肝竇狹窄,肝竇內(nèi)淤血,匯管區(qū)及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集,膽管上皮細(xì)胞腫脹(HE×200)。圖4 12h I/R組肝實(shí)質(zhì)、肝竇內(nèi)中心粒細(xì)胞明顯增多,部分肝細(xì)胞核固縮紅染(HE×200)。

表1 sham組與I/R組ADC×10-3mm 2/s比較(±s)

表1 sham組與I/R組ADC×10-3mm 2/s比較(±s)

討 論

1.肝I/R機(jī)制及DWI應(yīng)用于肝I/R檢測(cè)的可行性

肝臟微循環(huán)的障礙、肝細(xì)胞內(nèi)外水腫以及不斷加重的肝細(xì)胞壞死等是肝I/R基本病理生理過程,其中肝I/R微循環(huán)灌注改變以及伴隨灌注量的減少是促進(jìn)I/R病理過程發(fā)生、發(fā)展關(guān)鍵因素[1]。而DWI作為一種利用組織間彌散系數(shù)不同而產(chǎn)生的組織間對(duì)比來進(jìn)行成像的方法,能在分子水平上對(duì)活體組織結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)進(jìn)行無創(chuàng)性檢查,但是b值較小時(shí) (b＜300 s/mm2)微循環(huán)血流灌注對(duì)ADC值的影響在諸多影響因素中占主導(dǎo)作用,在血容量豐富的肝臟顯得尤為嚴(yán)重[5]。故本研究分別采用 b=20s/mm2、50s/mm2、100s/mm2較小梯度因子與較大的梯度因子b=300s/mm2、600s/mm2成像,觀察ADC值變化規(guī)律,與肝酶作相關(guān)性分析,探討小b值DWI能否更準(zhǔn)確地反映肝臟缺血再灌注損傷病理變化過程。

2.肝I/R后DWI-ADC變化規(guī)律及機(jī)制探討

本研究結(jié)果顯示在缺血再灌注6h后,與sham相比,ADC顯著下降,而在12h出現(xiàn)緩慢上升。肝左葉T2WI及DWI表現(xiàn)為高信號(hào),這意味肝臟損傷的持續(xù)、加重。其主要原因I/R后肝臟毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)血流狀態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)肝血流顯著的差異性分布,即肝細(xì)胞的生理狀態(tài)出現(xiàn)差異性。所以,肝細(xì)胞對(duì)損傷因素敏感性出現(xiàn)差異性反應(yīng)[1,2]。其發(fā)生機(jī)制:首先,在I/R的(＞6h)后期階段,各種有害物質(zhì)破壞了肝臟的微循或肝臟的微血管床或者肝血竇被大量功能喪失的紅細(xì)胞充填。同時(shí),由于肝血竇功能障礙致使肝動(dòng)脈介導(dǎo)的血管緩沖效應(yīng)喪失,使肝臟的血供減少;末端小動(dòng)靜脈間通路的開放使肝血竇的灌注量進(jìn)一步減少[7]。其次,肝臟微循環(huán)灌注量的減少使得肝細(xì)胞濃度相對(duì)增高,抑制水分子的運(yùn)動(dòng)能力?？傊?肝臟微循環(huán)灌注量的減少,導(dǎo)致肝細(xì)胞萎縮、肝竇解離、內(nèi)皮細(xì)胞脫落、中央靜脈和小門靜脈束萎縮。綜上以上因素,由于抑制水分子的運(yùn)動(dòng)因素增多而使ADC下降。再者,各種炎性介質(zhì)、超氧化物介導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)損害也是重要原因[2]。研究表明,肝竇及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)大量聚集的中性粒細(xì)胞不僅阻礙肝臟微循環(huán)的血流,而且誘導(dǎo)炎性反應(yīng)對(duì)肝實(shí)質(zhì)造成損傷(圖3,4)。肝酶ALT、ALP是評(píng)價(jià)肝功能丟失非常敏感的指標(biāo),其中ALT的升高代表了肝細(xì)胞膜的損害或者通透性增高,而本研究結(jié)果顯示ALT與較小的梯度因子b值的ADC呈顯著負(fù)相關(guān),也說明了選用較小b值DWI不但對(duì)肝I/R后微循環(huán)障礙具有較高的敏感性,而且能準(zhǔn)確地反映肝細(xì)胞的功能、形態(tài)等。至于ALP顯著升高,筆者認(rèn)為是其主要原因是在本實(shí)驗(yàn)中I/R模型的制作中不但阻斷了左半肝血液供應(yīng),同時(shí)阻斷了左肝管,在一定程度上具有部分急性梗阻性黃疸模型的特點(diǎn)。門靜脈與肝膽管同處于一Glisson鞘內(nèi),當(dāng)膽管上皮由于缺血發(fā)生腫脹時(shí),門靜脈便首先受壓,肝臟的血液灌流量減少,增加了微循環(huán)的阻力。另外,膽道損傷或梗阻易導(dǎo)致細(xì)菌感染和腸源性內(nèi)毒素血癥,可直接導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死。壞死的肝細(xì)胞又可引起炎癥細(xì)胞的集聚, 促進(jìn)了肝血竇內(nèi)微血栓形成,加重微循環(huán)障礙。這些致使肝I/R發(fā)展因素疊加使血清ALT和ALP逐漸上升而ADC逐漸下降。值得注意的是,在12h下降是暫時(shí)的,在筆者的后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)在24～48h(限于篇幅,筆者另文發(fā)表),ADC又明顯上升。所以,筆者認(rèn)為肝臟缺血再灌注損傷的復(fù)雜性和多因素的病理生理過程以及肝臟的兩套血供特點(diǎn)決定DWI成像ADC的多變性,這也是有別于腦的缺血再灌注損傷ADC變化特點(diǎn)[7,8]。

同時(shí),本實(shí)驗(yàn)也存在DWI-ADC監(jiān)測(cè)時(shí)間短以及選用兔作為研究對(duì)象受其呼吸頻率較快影響易產(chǎn)生磁敏感偽影,致使肝臟的邊緣易發(fā)生扭曲變形,影響ADC值的準(zhǔn)確性等缺點(diǎn)。

總之,3.0T DWI成像作為一種簡(jiǎn)單、方便、無需對(duì)比劑的成像方法,是對(duì)以往采用肝酶等方法來評(píng)估肝臟損傷程度的一個(gè)很好補(bǔ)充。因此,DWI在肝臟移植、肝臟腫瘤切除等易引起I/R的手術(shù)中具有很高的臨床使用價(jià)值,值得深入研究。

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