肝癌患者血清血管內(nèi)皮生長因子和內(nèi)皮抑素水平的變化及意義

楊煥東，楊桂蓮，張春元，張春梅，王慎田

血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和內(nèi)皮抑素 (endostatin)分別是目前已知的作用最強的血管生成促進(jìn)因子和抑制因子，深入研究兩者在腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用及手術(shù)前后的變化規(guī)律，對腫瘤早期診斷和判斷預(yù)后具有重要的臨床意義。關(guān)于原發(fā)性肝癌二者聯(lián)合檢測的意義未見報道。本研究采用ELISA法測定原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平，并以慢性乙型肝炎肝硬化和健康人群作為對照，探討血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平的變化及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年3月—2009年3月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院消化科和普外科收治的原發(fā)性肝癌患者163例 (肝癌組)，多屬于中、晚期，其中男112例，女51例;年齡28～69，平均 (53.2±10.5)歲。根據(jù)臨床癥狀和體征、B超、CT、腫瘤標(biāo)志物確診，部分病例術(shù)后經(jīng)病理切片進(jìn)一步診斷。另選取同期慢性乙型肝炎肝硬化患者75例 (肝硬化組)，其中男59例，女16例;年齡33～67歲，平均 (54.8±9.6)歲。同期健康志愿者及健康查體檢者60例 (正常對照組)，其中男42例，女18例;年齡24～71歲，平均 (52.3±11.2)歲。試驗前對所有受試者履行知情同意告知并獲同意后入選本試驗。

1.2 方法 所有患者于入院后未治療前清晨空腹 (健康人群則隨機(jī)清晨空腹)抽取外周靜脈血4 ml，室溫放置30～60 min后3 000 r/min離心10 min，分離并留取血清置-70℃低溫冷凍備用。部分手術(shù)和 (或)介入治療的患者于術(shù)后2周同法收集血清冷凍備用。用ELISA法測定血清VEGF及內(nèi)皮抑素水平，檢測方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。全自動酶標(biāo)儀測定光密度值 (D值)，VEGF檢測波長為450 nm，內(nèi)皮抑素檢測波長為490 nm。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)本的D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)濃度。人VEGF ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，人內(nèi)皮抑素ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，各組間均數(shù)比較用t檢驗或方差分析。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受檢者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較 肝癌組患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平均顯著高于肝硬化組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01);而肝硬化組與正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 原發(fā)性肝癌患者血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平與臨床特點及分期之間的關(guān)系 不同性別、是否合并肝硬化的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。腫瘤直徑＜5 cm者血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平顯著低于腫瘤直徑＞5 cm者，有門靜脈癌栓的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平顯著高于無靜脈癌栓的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01)。TNMⅠ、Ⅱ期的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);但當(dāng)腫瘤發(fā)展到Ⅲ、Ⅳ期時，血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平顯著升高，與Ⅰ、Ⅱ期比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01，見表2)。

表1 肝癌組、肝硬化組、正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

表1 肝癌組、肝硬化組、正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

注:與肝硬化組及正常對照組比較，*p＜0.01

組別 例數(shù) VEGF 內(nèi)皮抑素肝癌組 163 412.3 ±145.6* 45.6 ±11.7*肝硬化組 75 168.5 ± 72.4 33.2 ± 9.6正常對照組 60 164.6 ± 68.5 31.4 ±10.4 F 值＜0.01 ＜0.01 11.7 8.4 P值

表2 原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平與臨床特點及分期之間的關(guān)系Table 2 Relationship between serum VEGF and endostatin levels and clinicopathologic features in hepatocellular carcinoma

2.3 原發(fā)性肝癌患者術(shù)前術(shù)后血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平的變化 107例肝癌患者行外科和 (或)介入手術(shù)治療，術(shù)前血清VEGF水平為 (388.4±124.2)ng/L，術(shù)后 2周下降為(213.5±98.3)ng/L;術(shù)前血清內(nèi)皮抑素水平為 (42.5±10.4)ng/L，術(shù)后 2 周明顯升高，為 (53.8 ±11.9)ng/L。術(shù)前、術(shù)后VEGF、內(nèi)皮抑素水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為11.45 和7.40，P ＜0.01)。

2.4 血清VEGF水平和內(nèi)皮抑素水平之間的相關(guān)性 肝癌組患者術(shù)前內(nèi)皮抑素水平與VEGF水平呈正相關(guān) (r=0.658，p＜0.01)，而肝硬化組和正常對照組受檢者內(nèi)皮抑素水平與VEGF水平無相關(guān)性 (r值分別為0.178和0.087，P＞0.05)。

3 討論

腫瘤血管新生是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。新生血管不僅為腫瘤生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧以及排出代謝廢物，并為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)和轉(zhuǎn)移提供可能，因此血管生成在腫瘤形成以及以后的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極為重要的作用，是腫瘤得以迅速生長和發(fā)展的關(guān)鍵［1］。腫瘤血管生成是一個多基因、多因子參與的過程，在這一過程中腫瘤細(xì)胞不僅能分泌許多種促進(jìn)血管形成、加速腫瘤發(fā)展的因子，同時也能分泌許多抑制血管形成、促使腫瘤消退、凋亡、防止轉(zhuǎn)移的因子［2-3］。該過程受到“血管生成開關(guān)”系統(tǒng)精密調(diào)控，使血管生成刺激因子和抑制因子保持平衡［4］。腫瘤生長還是消減取決于促進(jìn)血管生長因子和抑制血管生長因子含量的變化［5］。VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的血管生成調(diào)控因子［6］，它不僅能與位于血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)血管和淋巴管的生成、增加其通透性而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，還能通過自分泌途徑與腫瘤細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，直接促進(jìn)腫瘤生長［7］。近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮抑素則被認(rèn)為是迄今為止最有效的內(nèi)源性血管生長抑制因子之一［8］。體外和動物實驗表明內(nèi)皮抑素及其類似物在體外能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長、移行，在體內(nèi)顯著退縮和停滯原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長［8］。內(nèi)皮抑素可競爭性阻斷VEGF誘導(dǎo)血管生成的信號傳導(dǎo)通路，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞膜VEGF受體的數(shù)量，降低體內(nèi)VEGF mRNA水平表達(dá)［9］。內(nèi)皮抑素和VEGF的作用相互拮抗，共同影響腫瘤新生血管的生成。有關(guān)聯(lián)合檢測肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平及其手術(shù)前后動態(tài)變化的研究未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平均顯著高于良性病變慢性乙型肝炎患者和健康者，與Kuroi等［10］的研究結(jié)果一致，表明肝癌細(xì)胞確能分泌大量的VEGF，促進(jìn)腫瘤血管生成，以提供腫瘤細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供條件。同時，腫瘤組織通過多種途徑刺激機(jī)體產(chǎn)生大量內(nèi)皮抑素，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤部位，抑制原發(fā)和繼發(fā)腫瘤血管的生成，與血管生成促進(jìn)因子的作用相拮抗，達(dá)到一種平衡。

本研究觀察到，肝癌患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平與原發(fā)腫瘤大小、有無門靜脈癌栓以及臨床病理分期密切相關(guān)，而且術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平呈明顯正相關(guān)。隨著腫瘤增大，血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平明顯升高。隨著腫瘤分期的不斷進(jìn)展，血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平亦不斷升高，Ⅲ期和Ⅳ期肝癌患者的血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。說明隨著惡性程度的升高，腫瘤分泌VEGF、內(nèi)皮抑素均增加，但兩者增加的程度可能并不平行，加之腫瘤組織還可產(chǎn)生其他血管生成促進(jìn)因子和抑制因子，使得“血管生成開關(guān)”處于開放狀態(tài)，促血管生成效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢，惡性腫瘤得以無限制地生長、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究表明快速生長的癌組織極易出現(xiàn)缺血缺氧，導(dǎo)致VEGF大量分泌，以加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，促使新生血管生成，從而滿足腫瘤生長的需求。腫瘤的惡性程度越高，對氧的需求越高，VEGF的分泌也越多。同時，隨腫瘤惡性程度增高，蛋白水解酶分泌增加，降解血管基底膜中的膠原蛋白，使內(nèi)皮抑素的生成也相應(yīng)增加［11-12］。本研究認(rèn)為，術(shù)前血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平可反映腫瘤部位的血管增生程度及體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的大小，作為評價肝癌惡性程度及進(jìn)展程度的指標(biāo)，并有可能作為抗血管治療的效應(yīng)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，肝癌患者行手術(shù)治療后血清VEGF水平較術(shù)前均有明顯降低，而內(nèi)皮抑素水平則較術(shù)前升高。提示作為有效的治療手段，根治性手術(shù)的“去腫瘤負(fù)荷作用”解除了腫瘤對機(jī)體的浸潤及血管生成的影響，使得腫瘤新生血管生成減少，在一定程度上減緩了腫瘤的進(jìn)展，可作為判斷手術(shù)療效及預(yù)后的指標(biāo)。

1 李勝棉，張慧景，吳義娟，等.HBV相關(guān)及HCV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌組織中8-羥基脫氧鳥苷酸和CD34及Ki-67的表達(dá)研究 ［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(5):1669.

2 Gupta MK，Qin RY.Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis［J］.World J Gastroenterol，2003，9(6):1144-1155.

3 徐英，顏浩.惡性腫瘤雌激素受體及其拮抗劑與血管內(nèi)皮生長因子關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18(5):683.

4 Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis ［J］.Semin Oncol，2002，29(6 Suppl 16):15-18.

5 Aragon-Ching JB，Dahut WL.The role of angiogenesis inhibitors in prostate cancer［J］.Cancer J，2008，14(1):20-25.

6 K?sem M，Tuncer I，Kotan C，et al.Significance of VEGF and microvascular density in gastric carcinoma ［J］.Hepatogastroenterology，2009，56(93):1236-1240.

7 陶曉峰，劉暢.缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子與肝細(xì)胞癌分化及其侵襲性的相關(guān)性研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(1):164.

8 Faye C，Chautard E，Olsen BR，et al.The first draft of the endostatin interaction network ［J］.J Biol Chem，2009，284(33):22041-22047.

9 Kim YM，Hwang S，Kim YM，et al.Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1 ［J］.J Biol Chem，2002，277(31):27872-27879.

10 Kuroi K，Tanaka C，Toi M.Circulating levels of endostatin in cancer patients［J］.Oncol Rep，2001，8(2):405-409.

11 Feldman AL，Alexander HR Jr，Bartlett DL，et al.A prospective analysis of plasma endostatin levels in colorectal cancer patients with liver metastases ［J］.Ann Surg Oncol，2001，8(9):741-745.

12 Fernando NT，Koch M，Rothrock C，et al.Tumor escape from endo-genous，extracellular matrix-associated angiogenesis inhibitors by upregulation of multiple proangiogenic factors［J］.Clin Cancer Res，2008，14(5):1529-1539.