馬齒莧提取物體外清除自由基活性的研究

楊 柳,陳承杰,辛海量,李 敏*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系軍隊(duì)衛(wèi)生學(xué)教研室,上海 200433;2.上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心五大衛(wèi)生科,上海 201700;3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科,上海 200433)

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)系馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質(zhì)草本植物,是藥食同源野生植物之一,既有保健功能,又有藥用價(jià)值。研究表明,馬齒莧能降低家兔體內(nèi)的血清脂質(zhì)和血黏度,具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗缺氧作用[1]。本研究自制馬齒莧提取物,對(duì)其清除自由基的活性進(jìn)行體外研究,為充分開發(fā)利用這一天然資源提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(魯伊科工貿(mào)公司);751型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)技術(shù)有限公司);TG332A型微量分析天平(上海天平儀器廠);H Y31-02電熱恒溫水浴鍋(紹興醫(yī)療器械廠),T/UT6030恒溫干燥箱和Labofuge400R高速低溫離心機(jī)(德國 Heraeus公司)。1,1-二苯基-2-(2′,4′,6′-三硝基苯基)肼(DPPH)(日本東京和光純藥工業(yè)株式會(huì)社);無水乙醇、95%乙醇(分析純)、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸均購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司;羥基自由基測(cè)試盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-?)測(cè)試盒均購自南京建成生物工程研究所;2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BH T)(含量99%,南京大唐化工有限責(zé)任公司,批號(hào)090603);沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-200302)和維生素C(批號(hào)100425-200702)均購自中國藥品生物制品檢定所;馬齒莧藥材(批號(hào)090728)購自上海雷允上藥業(yè)有限公司,經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鄭漢臣教授鑒定為馬齒莧科馬齒莧。

2 方 法

2.1 馬齒莧提取物的制備 稱取馬齒莧藥材500 g,用4000 ml 80%乙醇回流提取2次,每次1 h。合并提取液,減壓除乙醇,加蒸餾水至1 g生藥/ml,用10%NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH6.5～7.0,以2×103×g離心4 min,得沉淀,水洗沉淀物,繼續(xù)離心,沉淀經(jīng)干燥。將最終所得沉淀溶于無水乙醇中,分別配置成不同濃度的馬齒莧樣品液,待用。

2.2 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取25 mg DPPH置250 ml容量瓶中,用80%乙醇溶解并定容,配置成0.1 mg/ml的DPPH溶液。將2 ml不同濃度馬齒莧樣品液及2 ml DPPH溶液加入到同一支具塞試管中,搖勻。30 min后在 517 nm處用2 ml 80%乙醇作參比劑測(cè)定其吸光度Ai,同時(shí)測(cè)定2 ml DPPH溶液與2 ml 80%乙醇混合后吸光度A0、2 ml不同濃度馬齒莧樣品液與2 ml 80%乙醇混合后的吸光度Aj。評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化能力的大小用清除率來表示。清除率計(jì)算公式:P1=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。陽性對(duì)照藥選擇沒食子酸,同法操作,并計(jì)算清除率。

2.3 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn) 嚴(yán)格按照羥基自由基試劑盒說明書操作。選擇維生素C作為陽性對(duì)照藥,同法按照試劑盒說明書操作,測(cè)定吸光度。清除率計(jì)算公式:P2=[(對(duì)照管的吸光度-測(cè)定管的吸光度)/對(duì)照管的吸光度]×100%。

2.4 抑制超氧陰離子自由基(O2-?)實(shí)驗(yàn) 嚴(yán)格按照超氧陰離子自由基試劑盒說明書操作。選擇維生素C作為陽性對(duì)照藥,同法按照試劑盒說明書操作,測(cè)定吸光度。清除率計(jì)算公式同2.3項(xiàng)。

2.5 測(cè)定還原能力實(shí)驗(yàn) 取0.5 ml不同濃度的馬齒莧樣品溶液分別置 10 ml比色皿中,加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 ml,1%的鐵氰化鉀溶液2.5 ml,混勻,50℃下保溫20 min后,加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml,振蕩混勻后在4℃和1.5×103×g下離心 10 min。取上清液2.5 ml,加入2.5 ml蒸餾水和0.5 ml0.1%的FeCl3溶液,靜置10 min后,溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色,在700 nm下進(jìn)行比色。用蒸餾水代替馬齒莧樣品液做空白實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照品為人工合成抗氧化劑BHT,同法操作,并測(cè)定吸光度。每種濃度下平行測(cè)定3次。溶液的吸光度越大,表示還原能力越強(qiáng)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)濃度平行測(cè)量3次,結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用兩因素析因設(shè)計(jì)定量資料一元方差分析,對(duì)清除率做了平方根反正弦變換。數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果和討論

3.1 清除DPPH自由基 DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,呈紫色,在517 nm下有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),DPPH自由基與自由基清除劑給出的氫相結(jié)合,孤電子被配對(duì),使其顏色由紫色變?yōu)榈S,吸光度減少,反應(yīng)結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定[2]。因此,可通過在此波長(zhǎng)處吸光度的測(cè)定,來檢測(cè)自由基的清除情況。結(jié)果見表1。與藥物、劑量、藥物與劑量交互作用對(duì)應(yīng)的方差分析結(jié)果分別為:F=2 135.26,P＜0.000 1;F=10 897.1,P＜0.000 1;F=797.09,P＜0.000 1。說明兩種藥物之間的差別、5種劑量之間的差別、藥物與劑量的交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別在各劑量下比較兩種藥物之間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1)。

表1 馬齒莧提取物對(duì)DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

表1 馬齒莧提取物對(duì)DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼

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3.2 清除羥基自由基 羥基自由基最活潑,其反應(yīng)速率極快,可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子,尤其對(duì)脂質(zhì)的過氧化作用更強(qiáng)[3]。在低濃度時(shí)維生素C清除羥基自由基能力較強(qiáng),但在濃度達(dá)到2.50 mg/ml后趨于穩(wěn)定,清除活性不再顯著增加,而馬齒莧提取物的清除活性與濃度呈正相關(guān),在高濃度時(shí)清除活性明顯優(yōu)于維生素C,結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果與清除DPPH自由基結(jié)果基本相同。

3.3 清除超氧陰離子自由基 超氧陰離子自由基不僅具有重要的生物功能,也與多種疾病有密切關(guān)系。它是基態(tài)氧接受一個(gè)電子后形成的第一個(gè)氧自由基,可經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基[4]。表2結(jié)果顯示,維生素C在低濃度時(shí),清除超氧陰離子自由基的能力顯著優(yōu)于馬齒莧提取物,隨著濃度的升高,馬齒莧清除超氧陰離子自由基活性不斷增強(qiáng),效果逐漸優(yōu)于維生素C。方差分析結(jié)果與清除DPPH自由基結(jié)果基本相同。

表2 馬齒莧提取物對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

表2 馬齒莧提取物對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

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3.4 還原能力測(cè)定結(jié)果 抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的,還原力越弱,抗氧化性越強(qiáng)。因此,可通過測(cè)定還原力來說明抗氧化活性的大小。圖 1的結(jié)果顯示,在濃度0～200 μ g/ml范圍內(nèi),馬齒莧提取物的還原能力弱于對(duì)照藥BHT,即抗氧化力強(qiáng)于BH T。

圖1 馬齒莧提取物的還原能力Figure 1 Reducing ability of extract of Portulacaoleracea

馬齒莧在我國有悠久的食用歷史,是最常見的中草藥和野生蔬菜,藥理作用廣泛,它營(yíng)養(yǎng)豐富,且來源廣泛,有較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)藥用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧具有較強(qiáng)的清除自由基能力。馬齒莧的種植及其制品的開發(fā)具有廣闊的前景。但是馬齒莧的應(yīng)用仍然存在一些問題,首先其成分復(fù)雜,不能從分子水平上明確發(fā)揮藥性的有效成分;第二,我國馬齒莧資源雖然豐富,但多為野生,少有栽培,其利用率非常低。這些問題有待于科研人員進(jìn)一步的研究和探索。

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