cAMP-PKA信號(hào)通路對(duì)L02細(xì)胞藥物代謝酶CYP3A的調(diào)控作用

李 敏，張 冰，劉小青

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

肝是機(jī)體藥物代謝的主要器官，大多數(shù)藥物都要經(jīng)過(guò)肝代謝酶作用發(fā)揮效應(yīng)，其中細(xì)胞色素P4503A(cytochrome P4503A，CYP3A)是最主要的藥物代謝酶。CYP3A的活性直接影響藥物對(duì)機(jī)體的治療作用及毒性反應(yīng)［1］。CYP3A表達(dá)主要通過(guò)核受體孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)調(diào)控［2］。cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)體內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)，該信號(hào)通路可能調(diào)節(jié) CYP3A 的表達(dá)［3］。8-Br-cAMP和 H-89 分別是cAMP-PKA信號(hào)通路的激動(dòng)劑和抑制劑，本實(shí)驗(yàn)研究8-Br-cAMP及H-89作用于L02細(xì)胞，觀察CYP3A的變化，研究CYP3A的表達(dá)機(jī)制，探討該信號(hào)通路對(duì)藥物代謝酶的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

L02細(xì)胞由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物技術(shù)系王春梅老師惠贈(zèng)。錐蟲(chóng)藍(lán)(MTT)，8-Br-cAMP和H-89均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基(干粉)、胎牛血清、D-Hanks均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;無(wú)水甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸、異丙醇均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。胰酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Gibco公司。

超凈工作臺(tái)(天津醫(yī)藥凈化設(shè)備廠(chǎng));CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Nap-co公司);Bio-Rad-550酶標(biāo)儀(美國(guó)Metertech公司);低溫高速離心機(jī)、Nikon生物顯微鏡和NIS圖像采集分析系統(tǒng)(日本Nikon公司);電泳儀和轉(zhuǎn)膜機(jī)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法［4］檢測(cè)L02細(xì)胞活性

液氮罐中取出凍存的L02細(xì)胞株，復(fù)蘇培養(yǎng)，培養(yǎng)基為 1640(含 10%FCS，青霉素100 kU·L－1，鏈霉素100 kU·L－1)，置 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁大于85%時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)可傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳至第四、五代狀態(tài)較好時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度108L－1，培養(yǎng)12 h后，大于85%的細(xì)胞貼壁，吸出原培養(yǎng)基，按組別分別加入含藥的無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入 100 μl濃度為 10－3，10－4，10－5，10－6，10－7，10－8和10－9mol·L－1的 8-Br-cAMP 或 H-89 溶液，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加20 μl MTT 溶液5 g·L－1(pH=7.4)。繼續(xù)孵育4 h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加二甲亞砜150 μl，微量振蕩器振蕩10 min，在波長(zhǎng) 570 nm酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(absorbance，A)值，觀察8-Br-cAMP和H-89對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.3 L02細(xì)胞分組處理

L02細(xì)胞108L－1，接種于12孔板，正常對(duì)照組，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組，H-89 10 μmol·L－1組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，每組設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次，測(cè)PKA的培養(yǎng)孔中放入圓形蓋玻片，細(xì)胞爬片后做免疫組化用。

1.4 免疫組化法檢測(cè)PKA表達(dá)

有蓋玻片的培養(yǎng)板小心吸去培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛，4℃，固定24 h。取出蓋玻片，依次用PBS漂洗3×5 min，3%的H2O220 min。① 兔抗PKA抗體稀釋液(1∶100，武漢博士德)孵育24 h(4℃)，37℃復(fù)溫40 min，PBS漂洗3×5 min;②二抗羊抗兔IgG 37℃ 40 min，PBS漂洗 3×5 min;③ DAB 顯色。常規(guī)脫水、透明、封固，光鏡下觀察并拍攝照片。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定PKA陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分灰度值(著色深者灰度值低)進(jìn)行分析。

1.5 Western印跡法檢測(cè)PXR表達(dá)

小心傾去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，126×g離心5 min，小心吸出上清液，PBS再清洗，126×g離心5 min，倒凈 PBS，加入200 μl裂解液(1.4 ml單去污劑裂解液和 20 μl PMSF)，冰上裂解 30 min，4℃，13 427×g離心 8 min，吸取約 170 μl，－80℃保存待測(cè)。

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，每孔加40 μl蛋白，采用SDS-PAGE電泳，13%分離膠，5%的濃縮膠，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉1 h后加入β肌動(dòng)蛋白一抗4℃過(guò)夜(1∶2000)。用含吐溫-20的PBS(PBST)洗滌3次，每次5 min，加入二抗，密封，室溫1 h，PBST液洗3次，加入PXR 一抗(1∶150)，室溫1 h，PBST 液洗3 次，加二抗，PBST液洗3次，加顯色劑2 min，在暗室內(nèi)壓膠片曝光，觀察結(jié)果并掃描分析。PXR表達(dá)水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶的IA比值定量表示。

1.6 紅霉素-N-脫甲基法檢測(cè)CYP3A的活性

傾去培養(yǎng)液，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，4023×g離心10 min，吸出上清液，加入0.2 ml pH 7.4的甘油磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，1450×g，4℃離心15 min，取上清液，按照紅霉素-N-脫甲基法檢測(cè)CYP3A的活性［5］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 8-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞活力的影響

與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1使細(xì)胞活性明顯降低(P ＜0.05)，H-89 1 和 0.1 mmol·L－1使細(xì)胞活性明顯降低 (表 1)。所以8-Br-cAMP和H-89選擇對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損害的10 μmol·L－1作為實(shí)驗(yàn)濃度。

表1 8-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞活力影響Tab.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of L02 cells

2.2 8-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞PKA表達(dá)的影響

如圖1所示，PKA主要分布在胞漿之中，免疫組化染色后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞漿中分布著棕黃色陽(yáng)性顆粒。正常對(duì)照組有部分陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿分布有棕黃色顆粒，正常對(duì)照組PKA表達(dá)灰度值211±20相比，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，且陽(yáng)性顆粒著色較深，其陽(yáng)性面積及PKA表達(dá)灰度值(296±18)明顯增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，H-89 組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少、顆粒著色也比較淺，PKA表達(dá)灰度值(176±14)顯著降低(P ＜0.05)。

2.3 8-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞PXR表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于細(xì)胞后，細(xì)胞PXR表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，而 H-89 10 μmol·L－1組 PXR 表達(dá)沒(méi)有明顯差異(圖2)。

圖18-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞PKA蛋白表達(dá)影響 (×400).A:正常對(duì)照組;B:8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組;C:H-89 10 μmol·L－1組.Fig.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PKA in L02 cells(×400).

圖2 Western印跡法檢測(cè)8-Br-cAMP和H-89對(duì)LO2細(xì)胞孕烷X受體(PXR)表達(dá)的影響.1:正常對(duì)照;2:8-Br-cAMP 10 μmol·L － 1;3:H-89 10 μmol·L －1 .Fig.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PXR in L02 cells detected by Western blotting.

2.4 8-Br-cAMP和 H-89對(duì) L02細(xì)胞 CYP3A活性的影響

與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于L02細(xì)胞后，細(xì)胞CYP3A活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，H-89 10 μmol·L－1組細(xì)胞 CYP3A 活性無(wú)明顯差異(表2)。

表28-Br-cAMP和H-89對(duì)L02細(xì)胞中CYP3A活性的影響Tab.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of CYP3A in L02 cells

3 討論

肝藥物代謝酶的表達(dá)及活性變化直接影響藥物的體內(nèi)過(guò)程，使藥物血藥濃度變化，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。CYP3A是肝Ⅰ相藥物代謝酶中較為重要的代謝酶，介導(dǎo)臨床60%藥物的代謝，與藥物效應(yīng)密切相關(guān)，CYP3A的表達(dá)主要由上游因子PXR調(diào)控。cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)機(jī)體多種生物效應(yīng)［6］，與 CYP3A 的表達(dá)也密切關(guān)聯(lián)［3］。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察cAMP-PKA信號(hào)通路藥物代謝酶CYP3A的調(diào)控作用。L02細(xì)胞是體外培養(yǎng)的正常人類(lèi)肝臟細(xì)胞，肝臟是藥物代謝酶存在的主要器官，因此L02細(xì)胞中有較完整的肝臟藥物代謝酶系，可作為體外實(shí)驗(yàn)考察肝臟藥物代謝酶變化合適的細(xì)胞株。故實(shí)驗(yàn)選用L02細(xì)胞，考察cAMP-PKA通路激動(dòng)劑8-Br-cAMP、抑制劑H-89對(duì)L02細(xì)胞中CYP3A及PXR的影響，探討cAMP-PKA通路對(duì)CYP3A的調(diào)控的機(jī)制［7－8］。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 MTT［8］法觀察8-Br-cAMP，H-89對(duì)細(xì)胞活性的影響，選擇合適的實(shí)驗(yàn)濃度。結(jié)果顯示，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1有一定的細(xì)胞毒性，隨著濃度降低，對(duì)細(xì)胞損害越小，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1及更低的濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞基本沒(méi)有損害，故選用8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作為實(shí)驗(yàn)濃度。同樣選擇 H-89 10 μmol·L－1作為實(shí)驗(yàn)濃度。

8-Br-cAMP 和 H-89 10 μmol·L－1作用于 L02 細(xì)胞后，PKA，PXR和CYP3A都發(fā)生變化。8-Br-cAMP 10 μmol·L－1，可以增強(qiáng)細(xì)胞中 PKA 和 PXR 表達(dá)，并上調(diào) CYP3A 的活性，可見(jiàn) 8-Br-cAMP 10 μmol·L－1可以上調(diào)cAMP-PKA通路，并能增強(qiáng)PXR表達(dá)，從而使CYP3A 活性增強(qiáng)。H-89 10 μmol·L－1使 L02 細(xì)胞的PKA表達(dá)降低，對(duì)細(xì)胞的PXR表達(dá)、CYP3A的活性影響不大?？梢?jiàn)，cAMP-PKA信號(hào)通路處于上調(diào)狀態(tài)時(shí)可以增強(qiáng)PXR表達(dá)，從而增加CYP3A的活性，說(shuō)明cAMP-PKA信號(hào)通路可以調(diào)控CYP3A的表達(dá)。H-89 10 μmol·L－1使 cAMP-PKA 信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，PKA表達(dá)下降，PXR蛋白表達(dá)和CYP3A活性無(wú)明顯改變，說(shuō)明cAMP-PKA信號(hào)通路抑制時(shí)，可能存在其他途徑誘導(dǎo)PXR介導(dǎo)的CYP3A的表達(dá)，其綜合效應(yīng)使PXR蛋白表達(dá)和CYP3A活性無(wú)明顯變化，可見(jiàn)，除了cAMP-PKA信號(hào)通路，同時(shí)可能還有其他途徑共同調(diào)控CYP3A的表達(dá)。

cAMP-PKA信號(hào)通路在CYP3A表達(dá)中有積極意義，是影響CYP3A表達(dá)的途徑之一，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)宜從基因和蛋白層次觀察該通路對(duì)CYP3A表達(dá)的影響。可見(jiàn)，通過(guò)干預(yù)機(jī)體cAMP-PKA信號(hào)通路，影響CYP3A表達(dá)，可改變機(jī)體藥物代謝水平，為研究影響藥效的深層次機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 冷欣夫，邱星輝.細(xì)胞色素p450酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景［M］，北京:科學(xué)出版社，2001:78，139.

［2］ Lehmann JM，McKee DD，Watson MA，Willson TM，Moore JT，Kliewer SA.The human orphan nuclear receptor PXR is activated by compounds that regulate CYP3A4 gene expression and cause drug interactions［J］.J Clin Invest，1998，102(5):1016-1023.

［3］ Ding X，Staudinger JL.Induction of drug metabolism by forskolin:the role of the pregnane X receptor and the protein kinase a signal transduction pathway［J］.J Pharmacol Exp Ther，2005，312(2):849-856.

［4］ 張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998:1651-1652.

［5］ 孫大業(yè)，郭艷林，馬力耕.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:52，65.

［6］ 程?hào)|軍，徐永健，劉先勝，熊盛道，張珍祥.PKA和PKG信號(hào)通道對(duì)平滑肌細(xì)胞Kv亞型1.5表達(dá)的影響［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2007，28(16):1-3.

［7］ Lo KW，Ashe KM，Kan HM，Lee DA，Laurencin CT.Activation of cyclic AMP/protein kinase:a signaling pathway enhances osteoblast cell adhesion on biomaterials for regenerative engineering［J］.J Orthop Res，2011，29(4):602-608.

［8］ Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.