左旋鹽酸去甲基苯環(huán)壬酯對大鼠和小鼠震顫與行為的影響

閆加慶，李 昕，王麗韞，閆海濤，何新華，仲伯華，鄭建全

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所生化藥理研究室，北京 100850)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)又稱震顫麻痹，是一種以中腦黑質致密部多巴胺能神經元退行性變性為病理學標志的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，主要發(fā)生于中老年以上人群［1］。在中國，55歲以上發(fā)病率約為1.7%，隨年齡增長發(fā)病率也不斷提高［2］。PD在臨床上主要表現(xiàn)為運動障礙，包括靜止性震顫、肌肉僵直、步態(tài)失衡以及運動遲緩等。PD發(fā)病由于黑質致密部神經元退行性變性病變導致紋狀體內多巴胺能系統(tǒng)功能和膽堿能系統(tǒng)功能之間失衡，膽堿能功能相對亢進而出現(xiàn)肌肉震顫等臨床癥狀。但是造成多巴胺能神經元變性的原因目前尚未完全闡明，年齡、遺傳、環(huán)境、氧化應激和線粒體功能異常等因素在PD發(fā)病機制中起著重要作用［3－7］。

目前PD臨床以藥物治療為主，藥物包括擬多巴胺類和抗膽堿類兩種，通過增強多巴胺能系統(tǒng)功能和拮抗膽堿能系統(tǒng)功能重新恢復二者平衡而改善患者癥狀［8］。左旋多巴一直是臨床最主要的和治療效果最好的藥物，明顯改善患者運動癥狀。但用藥3～5年，約有80%患者出現(xiàn)突然、不預期的靜止和運動波動癥狀(開關反應)、服藥后作用持續(xù)時間縮短(劑末效應)和不自主運動增多等嚴重毒性作用，限制其應用［9－10］?？鼓憠A藥通過拮抗由于多巴胺能功能抑制引起的膽堿能功能相對優(yōu)勢，恢復多巴胺能-膽堿能平衡，對早期PD患者的震顫癥狀有明顯改善作用，而且該類藥物是治療服用抗精神病藥物導致錐體外系反應的唯一有效藥物。臨床使用的抗膽堿藥主要為苯海索，在發(fā)病早期可單獨應用或與左旋多巴合用推遲后者的用藥時間或降低用藥劑量減少毒性作用，但該類藥物由于選擇性低、副作用較大［11］，因此尋找療效好、安全性高的藥物成為目前治療PD藥物研發(fā)的主要方向。

鹽酸苯環(huán)壬酯(phencynonate hydrochloride)是北京毒物藥物研究所合成并已成功上市的Ⅰ類新藥，臨床用于治療暈動病。鹽酸苯環(huán)壬酯具有旋光異構體，其左旋體活性高于右旋，后進一步研究發(fā)現(xiàn)，左旋鹽酸苯環(huán)壬酯在體內的活性代謝產物為左旋去甲基鹽酸苯環(huán)壬酯(l-demethyl phencynonate hydrochloride，R-DM8021)，為此北京毒物藥物研究所合成了R-DM8021。前期研究發(fā)現(xiàn)，R-DM8021對毒蕈堿型M4受體親和力高于其右旋和消旋體，顯示出較強的抗膽堿作用［12－13］。M4受體主要分布于中樞紋狀體內，與 PD密切相關［14］，有望成為新的治療PD藥物。本研究通過建立6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損毀大鼠中腦黑質-多巴胺神經元的方法研究一次性給藥及長期給藥的作用效果;采用檳榔堿制備致小鼠肌肉震顫模型，研究R-DM8021抑制震顫的作用;采用C57BL/6小鼠制備 1-甲基-4 苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridin，MPTP)PD 模型，觀察對小鼠自發(fā)活動的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

R-DM8021由北京毒物藥物研究所藥物化學研究室提供，批號:090521，純度:99.78%;苯海索購自武漢銀河化工有限公司，批號:0090201;6-OHDA、地昔帕明和阿撲嗎啡(apomorphine，APO)均購自Sigma公司;氫溴酸檳榔堿購自上海西域機電系統(tǒng)有限公司;單臂腦立體定位儀購自深圳瑞沃德生命科技有限公司;吉量動物視頻分析系統(tǒng)購自北京吉安得爾生命科技有限公司。

1.2 動物

Wistar大鼠，雄性，體質量200～220 g，合格證號:SCXK-(軍)2007-004;昆明小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，合格證號:SCXK-(軍)2007-004;均由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。C57BL/6雄性小鼠，體質量 18～22 g，合格證號:SCXK(京)2007-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3 6-OHDA損毀大鼠中腦黑質-多巴胺神經元建立大鼠旋轉模型［15］

行為學檢查無自發(fā)旋轉的大鼠ip給予地昔帕明30 mg·kg－1防止6-OHDA被去甲腎上腺素能神經末梢攝取。ip給予水合氯醛400 mg·kg－1麻醉大鼠并固定于腦立體定位儀上。切開頭皮約1 cm，用5%過氧化氫溶液腐蝕筋膜。參照包新民等［16］著《大鼠立體定向圖譜》確定注射靶點的坐標為黑質致密部:前囟后4.8 mm，矢狀縫右側1.7 mm，硬腦膜下7.5 mm;紋狀體:前囟后1.0 mm，矢狀縫右側4.0 mm，硬腦膜下5.0 mm。按照確定坐標小心鉆透顱骨，將微量進樣器以1 mm·min－1速度進至預定深度。向目標部位注射6-OHDA 8 μg(溶于4 μl含質量分數(shù)0.002抗壞血酸的人工腦脊液中)，注射速度為1 μl·min－1。注射完畢后留針 15 min，以1 mm·min－1速度緩慢退針，正常對照組以等量人工腦脊液代替?？p合傷口，連續(xù)7 d im給予青霉素100 000 U·kg－1防止感染。術后7 d，ip給予 APO 0.5 mg·kg－1，計數(shù)大鼠開始旋轉后 30 min 內向健側旋轉次數(shù)，超過210次則視為建模成功。

1.3.1 單次給藥實驗

取第一次 ip 給予 APO 0.5 mg·kg－1后 30 min向健側旋轉次數(shù)＞210次的大鼠，每組6只，24 h后再次注射APO誘導旋轉，在第2次注射APO誘導旋轉前30 min按照分組分別ig給予生理鹽水(模型對照組)，R-DM8021 0.2，0.5，1.0，2.0 mg·kg－1和苯海索 3.0，5.0 和 10.0 mg·kg－1，記錄各組大鼠 30 min內向健側旋轉次數(shù)。結果采用變化率表示，變化率(%)=(給藥后旋轉次數(shù)－給藥前旋轉次數(shù))/給藥前旋轉次數(shù)×100%。

1.3.2 給藥21d治療實驗

取第一次 ip 給予 APO 0.5 mg·kg－1后 30 min向健側旋轉次數(shù)＞210次的大鼠，每組6只，在第2次注射APO誘導旋轉前30 min按照分組分別ig給予生理鹽水(模型對照組)，R-DM8021 0.2，0.5，1.0，2.0 mg·kg－1和苯海索 2.0 mg·kg－1，連續(xù)給藥21 d，每天2次。分別于第7，14和21天藥后30 min再次注射APO誘導旋轉。治療結果采用變化率表示。

1.3.3 觀察給藥7 d模型大鼠的自發(fā)活動［17］

記錄大鼠 ip 給予 APO 0.5 mg·kg－1后 30 min向健側旋轉次數(shù)，超過210次者按照分組ig給予生理鹽水(正常對照組和模型對照組)，R-DM8021 0.2，0.5，2.0 和苯海索 2.0 mg·kg－1，每組6 只，每天2次，連續(xù)給藥7 d后記錄各組大鼠在10 min內自發(fā)活動路程。

1.4 檳榔堿致小鼠肌肉震顫模型的建立及分組［18］

將昆明小鼠隨機分為模型組、R-DM8021 0.25，0.5，0.75，1，2.5，5，7.5，10，15，20，30 和 40 mg·kg－1以及苯海索 5，10，15，20，30，40，50，60，80和 100 mg·kg－1組，ig給予相應劑量藥物，30 min后 ip注射氫溴酸檳榔堿 35 mg·kg－1，記錄小鼠自注射檳榔堿后震顫反應持續(xù)時間以對震顫持續(xù)時間的抑制率為指標評價兩藥作用，震顫持續(xù)時間抑制率(%)=(持續(xù)時間模型組－持續(xù)時間藥物組/持續(xù)時間模型組×100%。

1.5 MPTP小鼠PD模型的建立及分組［19］

將雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組、模型組、R-DM8021 5.0，10.0 和 20.0 mg·kg－1和苯海索 20.0 mg·kg－1組，模型組和 R-DM8021 組連續(xù) ip注射MPTP 30 mg·kg－17 d建立小鼠PD模型，正常對照組以等量生理鹽水代替。模型建成后ig給予相應劑量藥物，正常對照和模型組以等量生理鹽水代替。每天2次，連續(xù)給藥3 d，記錄動物在3 min內自發(fā)活動路程。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 R-DM8021對6-OHDA模型大鼠APO誘導旋轉行為的影響

多數(shù)成功模型大鼠于術后3～4周出現(xiàn)穩(wěn)定的APO誘導的旋轉行為，模型成功率為55%。表1結果顯示，與模型對照組相比，單次ig給予R-DM8021 0.2 ～2.0 mg·kg－1分別使 APO 誘導的旋轉次數(shù)增加(17.3 ± 4.5)% ～ (31.7 ±5.5)%;苯海索 3.0，5.0和10.0 mg·kg－1組 分 別增 加(18.8 ± 4.8)%，(22.2 ±17.3)%和(36.9 ±10.0)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表2結果顯示，連續(xù)給藥21 d，大鼠APO誘導的旋轉次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，并維持在穩(wěn)定的水平，與等劑量的苯海索相比，R-DM8021對APO誘導旋轉的作用更強，但無統(tǒng)計學差異。

2.2 R-DM8021對大鼠自發(fā)活動路程的影響

與正常對照組比較，建模成功后，模型組大鼠10 min內自發(fā)活動路程顯著降低(P＜0.01)，連續(xù)給予R-DM8021和苯海索7 d可明顯提高大鼠自發(fā)活動路程(P＜0.05)(表3)，R-DM8021對大鼠自發(fā)活動的改善效果顯著優(yōu)于等劑量的苯海索(P ＜0.01)。

表1 單次給予左旋去甲基鹽酸苯環(huán)壬酯(R-DM8021)對阿撲嗎啡(APO)誘導大鼠旋轉行為的影響Tab.1 Effect of single administration of l-demethyl phencynonate hypdrochloride(R-DM8021)on rotation test evoked by apomorphine(APO)in rats

表2 長期給予R-DM8021對APO誘導大鼠旋轉行為的影響Tab.2 Effect of long-term administration of R-DM8021 on rotation test evoked by APO in rats

表3 給予R-DM8021 7 d對大鼠自發(fā)活動的影響Tab.3 Effect of R-DM8021 for 7 d on locomotor activity in rats

2.3 R-DM8021對檳榔堿致小鼠肌肉震顫模型震顫持續(xù)時間的影響

小鼠ip給予檳榔堿35 mg·kg－1后，出現(xiàn)明顯肌肉震顫，持續(xù)時間為(8.9 ±1.0)min，R-DM8021 和苯海索均可劑量依賴性地降低小鼠肌肉震顫持續(xù)時間(圖1)，R-DM8021 40 mg·kg－1和苯海索100 mg·kg－1可完全阻斷檳榔堿致小鼠肌肉震顫反應，兩藥對檳榔堿致小鼠肌肉震顫持續(xù)時間抑制作用的ED50分別為(6.87 ±1.33)mg·kg－1和(41.14 ±9.31)mg·kg－1，兩者相比具有顯著性差異(P＜0.01)。

圖1 R-DM8021和苯海索對檳榔堿致小鼠震顫持續(xù)時間的影響.ig給予 R-DM8021 0.25～40 mg·kg－1以及苯海索 5～100 mg·kg－130 min 后，ip 注射氫溴酸檳榔堿 35 mg·kg－1.震顫持續(xù)時間抑制率(%)=(模型組持續(xù)時間－藥物組持續(xù)時間)/模型組持續(xù)時間 ×100%.±s，n=8.Fig.1 Effect of R-DM8021 and trihexyphenidyl on the duration of tremor evoked by arecoline hydrobromide in mice.

2.4 R-DM8021對MPTP模型小鼠自發(fā)活動路程的影響

表4結果顯示，建模成功后，小鼠3 min內自發(fā)活動路程較正常組顯著降低(P＜0.01)，連續(xù)ig給予R-DM8021和苯海索3 d可明顯提高小鼠自發(fā)活動路程，R-DM8021對小鼠自發(fā)活動的改善效果顯著優(yōu)于等劑量的苯海索(P＜0.01)。

表4 R-DM8021 和苯海索對 1-甲基-4 苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)模型小鼠自發(fā)活動路程的影響Tab.4 Effect of R-DM8021 and trihexyphenidyl on locomotor activity in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridin(MPTP)model mice

3 討論

本研究在3種PD模型上評價新型抗膽堿藥R-DM8021對模型動物行為的改善作用。結果表明，R-DM8021對3種PD模型動物行為的改善效果均優(yōu)于臨床常用抗膽堿藥苯海索。本研究結果為臨床開發(fā)新型抗膽堿藥提供實驗依據(jù)。

6-OHDA大鼠模型是經典的PD模型，能較好地模擬PD早期病理變化。6-OHDA損毀大鼠黑質神經元后損毀側紋狀體內多巴胺受體數(shù)量代償性上調，敏感性增高，在多巴胺受體激動劑APO的作用下大鼠出現(xiàn)向健側旋轉的行為，旋轉次數(shù)與其損傷側黑質神經元的損傷程度和多巴胺受體的敏感性成正比［20］。大鼠實驗結果發(fā)現(xiàn)，R-DM8021單次和長期給藥均能顯著增加模型大鼠APO誘導的旋轉次數(shù)，而R-DM8021本身并不能誘導模型大鼠出現(xiàn)旋轉行為，這提示R-DM8021能夠協(xié)同APO增強后者對多巴胺受體的激動能力，其機制可能與增加損傷側多巴胺受體功能有關，包括表達量的上調和敏感性的提高。此外，長期給予R-DM8021還能顯著增加模型大鼠自發(fā)活動路程，且效果優(yōu)于等劑量的苯海索，結果提示R-DM8021可顯著改善6-OHDA定向損毀誘導的運動失能，療效優(yōu)于臨床常用藥物苯海索。

在肌肉震顫模型上，R-DM8021能顯著降低模型小鼠肌肉震顫持續(xù)時間，ED50約為苯海索的1/6，抗膽堿作用顯著強于后者，這可能與對M受體的親和力和選擇性有關，具體機制將進一步探討。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代，具有特異性的神經毒性作用，MPTP能被黑質神經元選擇性吸收通過阻斷線粒體呼吸鏈復合物I的活性造成神經元的損傷，能導致人類及多種動物出現(xiàn)PD癥狀，被廣泛用于建立PD模型［21］。在該模型上本研究進一步觀察到與等劑量苯海索相比，R-DM8021對模型小鼠自發(fā)活動的改善作用顯著強于前者，藥效學評價同樣強于臨床常用藥物苯海索，該作用可能對M受體的親和力和選擇性有關，對其具體機制的理解需要進一步研究。

綜上所述，R-DM8021對3種PD動物模型的治療作用均優(yōu)于苯海索，有望成為治療PD的新型抗膽堿藥。

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