耐力訓練對ApoE-/-小鼠AS形成及病理變化的干預作用研究

劉善云 何玉秀 張洪俠 馮紅 王洪濤 王敏 徐新女 王金環(huán)

1 天津體育學院運動人體科學系（天津 300381）2 河北師范大學體育學院

3 天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室4 天津中醫(yī)藥大學臨床實訓教學部

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種與血脂異常及血管壁成分改變有關的動脈疾病。其病理改變以動脈壁脂質(zhì)沉積和粥樣斑塊形成為主要特征，AS斑塊的不穩(wěn)定、破裂及隨后的血栓形成是臨床急性心肌梗死和冠心病猝死發(fā)生的主要原因[1，2]。如何預防（或延緩）和治療（或消退）AS是臨床醫(yī)學及運動醫(yī)學領域極為關注的課題。運動訓練是AS綜合防治中的重要干預手段之一，在運動防治AS早期研究工作中，大多從運動對脂代謝影響的角度闡明運動抗AS的作用，顯示了有氧運動通過改善血脂代謝和控制致AS的危險因素而起到防治AS的作用及潛在的抗AS機制[3]。近期研究有學者應用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠建立實驗動物模型，證明有氧運動對AS斑塊的形成起到顯著的預防和減輕病變程度的作用[4-7]，提供了運動抗AS的直接證據(jù)。但運動對于已經(jīng)形成的AS的治療或干預效果還缺乏相關研究報道，運動能否消除AS斑塊或減緩其病理進程還有待于進一步探討。為此，本研究以ApoE-/-小鼠為實驗對象，在復制AS模型過程中實施耐力運動干預，通過對實驗動物主動脈AS斑塊面積進行定量分析并結合病理形態(tài)學觀察，深入探討耐力運動對AS形成的預防作用和對已經(jīng)形成的AS的治療或干預效果，為進一步闡明運動防治AS提供實驗與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取8周齡ApoE-/-小鼠48只，雄性，體重20～22克，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心[合格證號：scxk（京）2006-2008 ]，飼以高脂高膽固醇膳食（膽固醇0.15%，脂肪21%），二級條件飼養(yǎng)。

將ApoE-/-小鼠隨機分為AS預防組（14周實驗組）和AS治療組（26周實驗組）：14周AS模型組（H組）、14周跑臺運動組（HE組）、26周AS模型組（HH組）、14周造模+12周跑臺運動組（H+E組），每組12只。選取同品系8周齡C57BL/6J小鼠24只作為對照組，分為14周對照組（N1組）和26周對照組（N2組），飼以標準動物飼料。每組12只。各組動物均自由飲食、飲水。實驗室環(huán)境溫度為22～24℃，相對濕度為50%，自然光照。

1.2 運動干預實驗

令HE組和H+E組小鼠在動物活動跑臺上進行耐力性訓練，依據(jù)加拿大學者Fernando等[8]研究資料，采用逐漸遞增運動強度和時間的運動方式，由10 m/min、30 min/次逐漸增加至13 m/min、60 min/次（運動強度約相當于75%最大攝氧量），每周訓練5次。HE組持續(xù)訓練14周，H+E組持續(xù)訓練12周。每天上午9:00～10:00進行訓練。在實驗過程中每周測量小鼠體重，觀察其生長狀況及對運動負荷的適應能力等。

1.3 取材及組織處理

動物處死前禁食12小時，運動干預組停止訓練24小時，以消除最后一次運動的急性效果。采取眼球摘除法取血后迅速打開胸腹腔，暴露心臟和主動脈，從心尖部用注射器注入DEPC水進行沖洗，剪開右心耳以便流出沖洗液（慢速注入），避免破壞斑塊完整性。之后取出全心臟（包括主動脈弓），分離主動脈并小心地剝離和剔除血管外附著組織后，置于4%多聚甲醛中固定（>4小時）。將心臟及主動脈近心端1～1.5cm組織用OCT包埋后-20℃冰箱保存。采用BLATER冰凍切片機（ATTENPON公司）制作冰凍切片。

主動脈根部冰凍切片制作：參照Suzuki等[9]的方法，自小鼠心底部開始作橫斷面連續(xù)切片。從主動脈瓣尖出現(xiàn)起連續(xù)橫切，在顯微鏡下選取切片（主動脈橫斷面出現(xiàn)三個主動脈瓣尖時起至瓣尖消失），切片厚度7μm，每間隔10張取1張，分別用于油紅O（ORO）染色和HE染色等。

1.4 主動脈斑塊面積評估及組織形態(tài)學觀察

取各組小鼠主動脈切片進行ORO染色，動脈粥樣斑塊呈紅色，利用計算機全自動圖像分析系統(tǒng)Leica Qwin V3（Leica公司Q550CW圖像分析儀）對主動脈斑塊面積進行定量分析。切片圖像由攝像頭直接采集輸入計算機，通過圖像分析軟件對油紅O染色部位斑塊面積及管腔總面積進行評估，參照Suzuki等[9]的方法，以主動脈斑塊面積/管腔總面積的比值來表示斑塊大小，以其平均值表示每組小鼠AS斑塊面積大小。另外，取各組小鼠主動脈HE染色切片，光鏡下觀察其組織形態(tài)學特征及各階段病理變化。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5進行統(tǒng)計處理，結果以均值±標準差（± s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，顯著性水平為P < 0.05和P < 0.01。

2 結果

2.1 各組小鼠主動脈AS斑塊面積

主動脈切片經(jīng)ORO染色顯示，正常對照組小鼠主動脈內(nèi)膜未見任何AS斑塊形成（圖1）。其他各組ApoE-/-小鼠主動脈AS內(nèi)膜均可見到被染成鮮紅色的脂肪團塊（AS斑塊）。

2.1.1 22周齡ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊的形成

H組（AS模型組）小鼠全部樣本主動脈根部血管內(nèi)膜上均可見到大量AS斑塊，主動脈斑塊面積占血管腔總面積的比例為41.79±6.93%。與H組相比，HE組（運動干預組）主動脈斑塊明顯減少，有的樣本僅限于局部（如瓣膜根部），主動脈斑塊面積與管腔面積比例為25.07±7.04%，顯著低于H組（P < 0.05），見表1和圖2。結果提示14周耐力運動能有效地減少ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊的形成。

2.1.2 34周齡ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊面積的變化

實驗持續(xù)14周時已致ApoE-/-小鼠形成動脈粥樣硬化，繼續(xù)給予12周高脂高膽固醇膳食后，HH組（34周齡）小鼠主動脈AS病變進一步加重。與H組相比，HH組小鼠主動脈斑塊面積明顯增大，主動脈斑塊面積與血管腔總面積比例達58.80±6.40%，顯著大于H組（P<0.01）。但與HH組比較，H+E組AS斑塊面積明顯減少，主動脈斑塊面積占血管腔總面積的比例為50.35±3.52%，顯著低于HH組（P<0.05）。結果提示12周耐力運動能有效地減緩已經(jīng)形成的AS斑塊的進展速度（表1，圖 3）。

表1 各組小鼠主動脈AS斑塊面積的比較

2.2 各組小鼠主動脈組織病理學觀察

主動脈切片HE染色觀察顯示，正常對照組C57BL/6J小鼠主動脈結構正常，血管內(nèi)膜未見任何AS病變（圖1）。其他各組ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜均可見到不同程度的AS病變。

2.2.1 22周齡ApoE-/-小鼠主動脈病理變化

H組小鼠主動脈管壁厚薄不均，內(nèi)膜明顯增厚，且表面粗糙，內(nèi)皮細胞腫脹、變性、部分缺失，可見由大量泡沫細胞形成的脂紋期病變和纖維斑塊期病變。結果提示，22周齡ApoE-/-小鼠已經(jīng)形成動脈粥樣硬化病變。但與H組相比，HE組小鼠主動脈斑塊少而薄，內(nèi)膜呈輕度不規(guī)則增厚，局部可見少量脂質(zhì)斑塊和輕度AS病變，內(nèi)膜厚度及泡沫細胞明顯減少，大部分AS病變限于脂紋期，病變程度較H組明顯減輕（圖2）。結果提示，14周耐力運動能有效地減輕ApoE-/-小鼠主動脈AS病變程度，從而發(fā)揮抗AS的作用。

2.2.2 34周齡ApoE-/-小鼠主動脈病理變化

圖1 正常對照組C57BL/6J小鼠主動脈HE染色（A）和ORO染色（B）

圖2 22周齡ApoE-/-小鼠（H組、HE組）主動脈HE染色和ORO染色

與H組相比，HH組小鼠AS病變加重，主動脈斑塊明顯增厚，管腔明顯狹窄，局部呈玻璃樣變性，可見大量的針狀空隙（膽固醇結晶）和炎性細胞浸潤，脂質(zhì)核心較大，顯示出易損斑塊特征（圖3：HH組-HE-100）。但與HH組比較，H+E組小鼠主動脈AS斑塊相對較薄，病變程度較HH組相對減輕，尚未見到明顯的膽固醇結晶和易損斑塊特征。結果表明12周耐力運動對ApoE-/-小鼠已經(jīng)形成的動脈粥樣硬化具有減緩其病變進展程度的作用。

3 討論

3.1 ApoE-/-小鼠AS模型的建立

動脈粥樣硬化的形成是一個長期、漸進的過程。研究者采用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，最早建立了AS小鼠模型，但其病理變化機制與人類AS 發(fā)病過程相差甚遠[10，11]。1992年研究者成功地復制出ApoE-/-小鼠AS模型，在正常飲食條件下能自發(fā)性形成AS病變[12，13]。由于其病變特點與人類AS疾病過程十分相似，因而成為目前研究AS發(fā)病機理與干預措施最為廣泛采用的理想的實驗動物模型。

本研究結果顯示，8周齡ApoE-/-小鼠飼以14周高脂高膽固醇膳食至22周齡時，主動脈根部形成明顯的AS斑塊，斑塊面積占血管腔總面積的比例為41.79±6.93%，病理觀察也顯示，主動脈內(nèi)膜明顯增厚，并可見由大量泡沫細胞及膽固醇結晶形成的不同階段的AS病變。這表明本實驗已成功建立了ApoE-/-小鼠AS模型。

圖3 34周齡ApoE-/-小鼠（HH組、H+E組）主動脈HE染色和ORO染色

3.2 耐力訓練對ApoE-/-小鼠AS的預防/治療作用

3.2.1 耐力訓練延緩ApoE-/-小鼠AS的形成

根據(jù)Fernando等[8]的研究推斷，ApoE-/-小鼠在活動跑臺上進行13m/min、每次60min的耐力運動屬于中等強度有氧運動。從實驗動物的生長狀況和運動能力等方面分析，ApoE-/-小鼠對本研究確定的運動負荷具有較好的耐受性，實驗過程中小鼠精神狀態(tài)良好，體重穩(wěn)步增長，說明運動量較為適中。

本實驗結果證實，14周高脂高膽固醇膳食致模型組小鼠發(fā)生明顯的AS病變，而14周耐力運動干預使主動脈斑塊面積明顯減小，并使大部分AS病變停留于早期階段，表明本研究采用的耐力運動方案能有效延緩或阻抑AS斑塊形成，并減輕主動脈病變程度。結果充分證實，14周耐力訓練對ApoE-/-小鼠AS形成產(chǎn)生良好的干預效果。

國內(nèi)外學者對有氧運動或有氧運動結合飲食控制對防治AS的作用及其機制等方面進行了一些深入的研究。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10周游泳運動訓練（5次/周，120分/次）使ApoE-/-小鼠AS斑塊面積減小，內(nèi)膜損傷程度減輕[4]；12周跑臺運動（5次/周，60分/次）使ApoE-/-小鼠AS斑塊面積較安靜對照組顯著減少（下降了34.4%）[5]；10周中等強度跑臺有氧運動組和低脂膳食組ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊面積均較對照組顯著減少[14]。這些研究結果均證實，有氧運動或有氧運動結合低脂膳食對ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成具有明顯的干預作用。

另有研究報道，運動對ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成無明顯影響[15，16]，這可能與所采用的運動負荷方式和運動強度等因素不同有關，其中運動強度過大可能是影響研究結果的主要原因。

3.2.2 耐力訓練延緩ApoE-/-小鼠AS病變的進展

為了進一步觀察耐力運動對已經(jīng)形成的AS的干預效果，本研究設計了HH組（14周造模+繼續(xù)12周造模組）和H+E組（14周造模+12運動干預組）。兩組小鼠飼以14周高脂膳食至22周齡時已形成典型的AS病變，在此基礎上HH組小鼠繼續(xù)飼12周高脂膳食，而H+E組小鼠在繼續(xù)飼高脂膳食的同時進行12周耐力運動干預。本研究結果顯示，HH組小鼠在已形成AS的基礎上，繼續(xù)飼以高脂膳食12周后，其主動脈病變進一步加重，表現(xiàn)為AS斑塊面積明顯增大，且多數(shù)樣本病變嚴重，大多發(fā)展為纖維斑塊和粥樣斑塊病變，并且少數(shù)樣本中局部AS斑塊中出現(xiàn)較大的脂質(zhì)核心、較薄的纖維帽和局部的炎性細胞聚集等，呈現(xiàn)出易損斑塊的病理形態(tài)學特征，提示HH組小鼠AS病變進展已較嚴重。Nakashima等[17]報告，ApoE-/-小鼠的病變在8～10周齡時脂質(zhì)條紋逐漸形成，15～20周齡后逐漸出現(xiàn)纖維斑塊、粥樣斑塊甚至復合病變，病變最嚴重的部位為主動脈根部。本實驗結果表明，34周齡ApoE-/-小鼠已形成較嚴重的AS病變。

與HH組AS斑塊面積（58.80±6.40%）比較，H+E組（50.35±3.52%）明顯減少，但仍較H組AS斑塊面積（41.79±6.93%）增加。結果提示，12周耐力運動并未使ApoE-/-小鼠已經(jīng)形成的動脈粥樣硬化斑塊消退或減少，表明12周耐力運動并不能實現(xiàn)逆轉AS的效果，但能有效地延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進展。此外，主動脈組織病理分析提示，HH組小鼠AS病變已較為嚴重，但與HH組比較，H+E組小鼠AS病變程度明顯減輕。研究結果充分證實，耐力運動對ApoE-/-小鼠已形成的AS斑塊及病變進展起到了一定的干預作用。

4 總結

本實驗采用高脂膳食成功地誘導ApoE-/-小鼠AS的發(fā)生。14周耐力訓練能有效地預防ApoE-/-小鼠AS的形成。12周耐力訓練對ApoE-/-小鼠已經(jīng)形成的AS起到了減緩其病變進展的作用。

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