連作對烤煙根際土壤微生物數(shù)量和酶活性的動態(tài)影響

古戰(zhàn)朝，習向銀，劉紅杰，劉朝科，周顯波，湯書開，張重義，4

(1.河南農(nóng)業(yè)大學，河南鄭州450002;2.西南大學，重慶400715;3.川渝中煙工業(yè)公司，四川成都610031;4.福建農(nóng)林大學，福建 福州350002)

煙草是忌連作作物，由于受耕地有限、經(jīng)濟利益驅(qū)動和種植條件等因素的制約，煙葉生產(chǎn)耕作制度單一，也即連作或復種連作的面積越來越大，使得連作障礙成為煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的突出問題.趙凱等［1］對典型煙區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，烤煙連作3 a以上就會對煙葉的外觀與內(nèi)在質(zhì)量均產(chǎn)生顯著的不良影響.主要表現(xiàn)在中上等煙比例與煙葉的煙堿、還原糖、鉀含量以及施木克值、糖堿比和鉀氯比等重要化學指標上.晉艷等［2］在1998—2000年對連作烤煙煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)狀況的研究結(jié)果表明，連作造成煙株株高、葉面積指數(shù)、煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值、中上等煙比例、均價等均有不同程度的降低.導致連作障礙的因素相當復雜，如土壤微生物活動、土壤酶活性、土壤根系分泌物［3］、土壤養(yǎng)分狀況等.而微生物是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要參與者，土壤有機質(zhì)轉(zhuǎn)化所需能量的90%以上來自微生物的分解作用，是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力［4，5］.土壤中微生物的種類較多，有細菌、真菌、放線菌和原生動物等，數(shù)量也很大，它們具有較大的比表面積，代謝活動旺盛［6］.大部分土壤微生物對作物的生長發(fā)育是有益的，它們參與土壤的形成、物質(zhì)循環(huán)和肥力演變，是影響作物生長發(fā)育的重要環(huán)境條件之一.賈志紅等［7］通過提取土壤細菌總DNA，用PCR-DGGE法研究了烤煙輪作和連作對土壤細菌群落多樣性的影響，認為連作會導致土壤微生物多樣性下降.王茂盛等［8］研究表明，隨著煙草連作年限的增加，細菌數(shù)量下降，青枯病病原菌數(shù)量逐漸減少，真菌數(shù)量增加.土壤酶主要來自微生物和植株根系分泌等途徑，此外還有土壤動植物活體分泌和動植物殘體的分解［9］.連作可使土壤中磷酸酶和脲酶活性降低，使蔗糖酶活性增強，而轉(zhuǎn)化酶活性只有連作年限超過5 a后才表現(xiàn)出減少趨勢［10］.婁翼來等［11］研究發(fā)現(xiàn)，隨著植煙年限的延長，表層土壤過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶、脲酶和中性磷酸酶活性的變化均表現(xiàn)為先增強后減弱，而它們在次表層土壤中則均呈現(xiàn)不同程度的降低.于寧等［12］研究表明，與正茬煙田相比，連作煙田的轉(zhuǎn)化酶、脲酶、中性磷酸酶和過氧化氫酶活性顯著下降，這將直接影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化及作物對土壤養(yǎng)分的有效吸收.前人的研究結(jié)果表明，烤煙根際土壤受到烤煙根系生長的直接影響，烤煙根際土壤微生物和酶活性的平衡發(fā)展是預防煙草連作障礙發(fā)生的基礎(chǔ).但之前的研究對生育期內(nèi)烤煙根際土壤微生物數(shù)量和酶活性的動態(tài)變化情況研究較少，特別是在受控條件下的研究未見報道.本研究試圖通過修建隔離池探討不同連作年限對煙草移栽后5個時期的根際土壤微生物數(shù)量及其酶活性動態(tài)變化，為進一步研究烤煙連作對根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響，探討烤煙連作障礙的消減技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

該試驗于2010年在重慶市武隆縣和順鎮(zhèn)青木池村川渝中煙科技示范園隔離池內(nèi)進行.供試烤煙品種為云煙87.試驗設(shè)3個處理，分別為:處理1，正茬(未種植過煙草);處理2，連作3 a;處理3，連作8 a.試驗用土分別取自正茬、連作3 a和連作8 a的地塊耕層土壤.試驗地前茬作物一致，均為玉米.試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復，每小區(qū)面積5 m ×2.2 m.烤煙移栽期為2010－05－16，行株距為1.2 m×0.55 m，留葉數(shù)為21片.肥料種類為煙草專用肥和硝酸鉀.m(氮)∶m(磷)∶m(鉀)=1∶1.5∶2.5.施純氮量為 105 kg·hm－2，純氮 60% 于移栽前條施，40%按當?shù)刈贩柿晳T于團棵期追施.田間管理按重慶市煙草田間管理技術(shù)規(guī)程執(zhí)行.試驗土壤類型為黃壤，具體養(yǎng)分狀況見表1.

表1 不同處理土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分狀況Table 1 Soil nutrient status in different treatments

1.2 根際土樣的采集

烤煙根際土壤樣品的采集時間分別為移栽后45，65，75，98，113 d.采集方法為抖根法.用 5 點取樣法采集土樣，混合均勻后用無菌自封袋包裝，分2部分保存:一部分保存在4℃冰箱中，供土壤生物數(shù)量分析;一部分風干、研磨，過60目篩，供土壤養(yǎng)分及土壤酶活性分析.

1.3 項目分析測定方法

1.3.1土壤酶活性的測定 脲酶采用比色法，其活性用24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示;過氧化氫酶采用滴定法，其活性用1 h后1 g土壤的0.1 mol·L－1K2MnO4的毫升數(shù)表示;蔗糖酶采用比色法，其活性用24 h后1 g土壤葡萄糖的毫克數(shù)表示;磷酸酶采用比色法，其活性用24 h后1 g土壤釋放出的酚的毫克數(shù)表示［13］.

1.3.2 微生物區(qū)系分析 細菌在36℃下，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h;放線菌和真菌在28～30℃條件下，分別在高氏1號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d.

細菌、放線菌和真菌的計數(shù)采用平板計數(shù)法［14］.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對煙草根際土壤微生物數(shù)量的影響

由表2可知，根際土壤中細菌數(shù)量在烤煙生育期內(nèi)呈“升－降－升－降”的變化趨勢，且在移栽后65和98 d分別出現(xiàn)1個峰值.不同連作年限處理間相比較，連作3 a的細菌數(shù)量最多，且在移栽后98 d前與其它處理間存在極顯著性差異，正茬的細菌數(shù)量次之.連作8 a的細菌數(shù)量最少，且除在移栽后45 d與正茬的無顯著性差異外，與其它處理相比，在各個生育時期均存在極顯著性差異.各處理根際土壤中真菌數(shù)量均在移栽后65 d前逐漸增加到最高峰，之后逐漸下降.在各個生育時期根際土壤中真菌數(shù)量均以正茬的最多，最多時達到9.20 ×105個·g－1，連作 3 a的次之，兩者在移栽后65和75 d時存在顯著性差異，但在各生育時期均與連作8 a的存在顯著性差異.各處理間相比較來說，真菌數(shù)量隨著連作年限的增加呈下降趨勢.各處理根際土壤中放線菌數(shù)量在烤煙生育期內(nèi)除連作8 a呈下降趨勢外，其余2個處理均先降后升.不同處理間相比，連作3 a的放線菌數(shù)量最多，其次為正茬，且除移栽后75 d外，兩者放線菌數(shù)量在其余各生育時期均與連作8 a的存在極顯著性差異.

表2 連作年限對煙草根際土壤微生物數(shù)量的動態(tài)影響Table 2 Effect of microbial quantity in different consecutive cropping years

2.2 連作年限對煙草根際土壤脲酶活性的影響

從圖1可以看出，隨著烤煙生育期的推進，3個處理的根際土壤脲酶活性大致呈“升－降－升－降”的變化規(guī)律，且在移栽后65和98 d分別出現(xiàn)1個峰值.這說明在烤煙生育的旺長期和打頂后，需要較多的營養(yǎng)物質(zhì)供給，此時脲酶活性顯著增強，可以促進尿素的分解，滿足烤煙生長的需要.各處理之間，根際土壤脲酶活性在各時期均以連作3 a的最大，正茬次之，連作8 a的最小.在移栽后45 d時，3個處理根際土壤脲酶活性相差較小，但正茬、連作3 a與連作8 a之間存在顯著性差異，而正茬與連作3 a之間無顯著性差異.隨著烤煙的生長發(fā)育，正茬和連作8 a的根際土壤脲酶活性的差距又逐漸增大，且差異顯著.

圖1 連作年限對煙草根際土壤脲酶活性的影響Fig.1 Effect of urease activity in different consecutive cropping years

2.3 連作年限對煙草根際土壤磷酸酶活性的影響

從圖2可以看出，連作3 a的根際土壤磷酸酶活性移栽后113 d時，比45 d時下降了7.06%.各處理之間相比，各時期根際土壤磷酸酶活性大小為:連作3 a＞正茬＞連作8 a.正茬與連作8 a之間除移栽后65 d外，存在顯著性差異.在烤煙生育期內(nèi)，3個處理土壤磷酸酶呈“升－降－升－降”的變化趨勢，且在烤煙移栽后65和98 d分別出現(xiàn)1個峰.根際土壤磷酸酶的活性變化與烤煙的生長發(fā)育狀況相一致，在烤煙生育的旺長期(移栽后65至98 d)，需要較多的營養(yǎng)物質(zhì)供給，此時磷酸酶活性顯著增強，可以促進無機磷酸的釋放，滿足烤煙生長的需要.而在移栽98 d時連作8 a的峰值很小，這可能是由于隨著烤煙的生長發(fā)育，土壤中有機質(zhì)含量減少，導致土壤磷酸酶的活性降低［15］.

圖2 連作年限對煙草根際土壤磷酸酶活性的影響Fig.2 Effect of phosphatase activity in different consecutive cropping years

2.4 連作年限對煙草根際土壤蔗糖酶活性的影響

從圖3可以看出，隨著烤煙連作年限的增加，根際土壤蔗糖酶活性總體呈曲折下降趨勢，其中連作8 a的下降最為明顯，移栽后113 d時僅為移栽后45 d時的69.74%.根際土壤蔗糖酶活性與脲酶、磷酸酶的活性變化相似，在烤煙生長的移栽后65和98 d各出現(xiàn)1個峰.各處理之間，根際土壤蔗糖酶活性在烤煙生育各時期均存在顯著性差異，其中以連作3 a的最高，正茬的次之，連作8 a的最低.

圖3 連作年限對煙草根際土壤蔗糖酶活性的影響Fig.3 Effect of invertase activity in different consecutive cropping years

2.5 連作年限對煙草根際土壤過氧化氫酶活性的影響

由圖4可見，根際土壤過氧化氫酶活性在烤煙生育期內(nèi)曲折下降，其中連作3 a的下降最為明顯，移栽后113 d時的過氧化氫酶活性僅為移栽后45 d時的63.48%.各處理之間，同一時期土壤過氧化氫酶活性均以連作3 a的最高，正茬的次之，連作8 a的最小，且3個處理之間均存在顯著性差異.

圖4 連作年限對煙草根際土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxidase activity in different consecutive cropping years

3 結(jié)論與討論

微生物是土壤中有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力，正常的土壤中微生物數(shù)量一般是細菌最多.本試驗表明，各處理在整個烤煙生育期內(nèi)，細菌數(shù)量大致呈“升－降－升－降”的變化趨勢，放線菌數(shù)量除連作8 a呈連續(xù)下降趨勢外，其余2個處理均先降后升，但均低于移栽初期水平，這與郭紅祥等［16］的研究結(jié)果一致.不同處理之間比較，各時期根際土壤中細菌對烤煙連作表現(xiàn)敏感，數(shù)量下降明顯，隨著連作年限的增加，真菌數(shù)量也有較為明顯的下降，放線菌數(shù)量先升后降，變化較穩(wěn)定.李仲強等［17］認為，不同連作年限之間比較，放線菌數(shù)量變化之所以較穩(wěn)定，可能是由于放線菌與細菌相比，生長較慢、受農(nóng)業(yè)技術(shù)措施的影響也表現(xiàn)較慢的緣故.總體上根際土壤微生物數(shù)量隨著連作年限的增加均呈下降趨勢，這與胡元森等［18］的研究結(jié)果一致，他認為真菌數(shù)量的下降可能是由于少數(shù)真菌類群富集，多數(shù)真菌類群數(shù)量減少，種群變化呈單一趨勢導致數(shù)量減少.本研究表明，不同處理間真菌所占微生物數(shù)量的比例，隨連作年限的增加有明顯的上升趨勢，而細菌所占比例有所下降.連作導致根際土壤的細菌數(shù)量下降，一方面可能是因為連作導致土壤中養(yǎng)分含量失衡，造成土壤貧瘠，劉訓理等［19］的研究表明，土壤肥沃的煙區(qū)根際細菌的數(shù)量最多，真菌數(shù)量較少;土壤貧瘠煙區(qū)根際真菌的數(shù)量較多，細菌數(shù)量較少;另一方面可能是由于土壤根系分泌物濃度抑制土壤微生物生長發(fā)育造成的，而細菌和放線菌對此反應較為敏感，真菌對此反應不太敏感，導致土壤微生物中真菌比例增加.由此可以看出，連作雖降低了土壤細菌、真菌等微生物的數(shù)量，但由于細菌數(shù)量降低明顯，導致烤煙根際微生物中真菌的比例反而升高，使土壤微生物區(qū)系從高肥的“細菌型”向低肥的“真菌型”轉(zhuǎn)化，這與于貴瑞［20］、于廣武［21］和鄒莉等［22］研究連作大豆土壤微生物種群變化時得出的結(jié)論一致.

連作可能導致土壤中某一種養(yǎng)分過度消耗，結(jié)果迫使這些元素對作物的供應越來越不足，造成土壤養(yǎng)分的過度消耗［23］.作物主要生育時期內(nèi)，不同耕作方式下的土壤酶活性變化趨勢與作物的生長及需肥規(guī)律基本一致［24］，土壤酶活性能夠體現(xiàn)土壤的生物學活性，表征土壤的綜合肥力及土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進程［25］，人們通常用脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶等酶活性來評價土壤肥力和肥效.在本研究中，土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性以連作3 a最高，其次為正茬，連作8 a最低，且三者存在顯著性差異，結(jié)果表明，隨著連作年限的增加，土壤酶活性先升高后下降.這說明，短期連作使土壤酶活性升高，而長期連作會降低土壤酶活性.這與根際土壤微生物數(shù)量變化相一致，說明土壤酶活性隨土壤微生物數(shù)量和有機質(zhì)含量的變化而變化.在烤煙生育期內(nèi)，隨著烤煙生育期的推進，土壤酶活性大致呈“M”型的變化趨勢，且在移栽后65和98 d分別出現(xiàn)1個峰值，這亦可能是由于在烤煙的旺盛生長期內(nèi)，需要吸收大量的營養(yǎng)物質(zhì)，土壤酶活性的變化規(guī)律與烤煙生長特性表現(xiàn)出了一定的協(xié)調(diào)性.

薛小平等［26］研究認為，短期連作的烤煙根際土壤微生物群落與原始土壤的相比較，更適宜于煙株的生長.李坤等［27］的研究表明，葡萄短期種植根際土壤細菌和真菌的多樣性增加，且根圍土壤細菌和真菌的種群結(jié)構(gòu)不同于空地土壤.烤煙的根系分泌物為其次生代謝產(chǎn)物(化感物質(zhì))，張重義等［28］認為化感物質(zhì)引起植物產(chǎn)生自毒作用，是導致烤煙連作障礙的主導因子，自毒作用的方式具有濃度效應的特征.劉新虎等［29］的研究也發(fā)現(xiàn)，低濃度的根系分泌物對棉花幼苗植株的根長、株高、地下部分鮮重、地上部分鮮重有明顯的促進作用，而高濃度則有抑制作用.根系分泌物作為根際微生物的營養(yǎng)來源之一，密切影響其種類和數(shù)量.由此推測，烤煙短期連作(小于3 a)情況下烤煙生長與土壤根際微生物群落關(guān)系密切，而長期連作與化感物質(zhì)引起的連作障礙效應關(guān)系密切，該推測還有待進一步研究.

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