HMGB1與JAK2/STAT1信號通路在大鼠滑膜組織增殖中的相關性研究

張明峰，周守勤，白連祥，郭惠芳*，高麗霞，馬麗艷

（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院免疫風濕科，河北石家莊 050000；2.唐山鋼鐵集團有限公司醫(yī)院檢驗科，河北唐山 063020；3.河北省承德市第五醫(yī)院老年病科，河北承德 067500）

HMGB1與JAK2/STAT1信號通路在大鼠滑膜組織增殖中的相關性研究

張明峰1，周守勤2，白連祥3，郭惠芳1*，高麗霞1，馬麗艷1

（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院免疫風濕科，河北石家莊 050000；2.唐山鋼鐵集團有限公司醫(yī)院檢驗科，河北唐山 063020；3.河北省承德市第五醫(yī)院老年病科，河北承德 067500）

目的探討膠原誘導的關節(jié)炎大鼠中高遷移率族蛋白（high mobility group box，HMGB）1對磷酸化januS激酶（phoSpho-januS kinaSe，p-JAK）2/信號轉導及轉錄活化因子（Signal tranSducer and activator of tranScription，p-STAT）1信號轉導通路的調(diào)控作用。方法將WiStar大鼠隨機分成4組，正常對照Ⅰ組、正常對照Ⅱ組、模型Ⅰ組和模型Ⅱ組。光鏡下觀察關節(jié)組織結構變化。免疫組織化學檢測HMGB1、增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表達，流式細胞術檢測p-JAK2、p-STAT1和細胞因子信號傳導抑制蛋白1（SuppreSSor of cytokine Signaling，SOCS1）蛋白的表達。結果模型組大鼠隨病程延長滑膜組織增生、炎細胞浸潤、骨破壞加重，細胞核、細胞漿以及細胞外基質中HMGB1蛋白表達顯著增加，同時伴隨PCNA蛋白表達增加；與正常對照組相比，模型Ⅰ組p-JAK2、p-STAT1和SOCS1蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與模型Ⅰ組相比，模型Ⅱ組p-JAK2、SOCS1的表達量下降（P＜0.05），p-STAT1的表達量變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。p-STAT1 與HMGB1、PCNA的表達呈正相關（r=0.474，P=0.014；r=0.529，P=0.005）。結論HMGB1可能激活了JAK2/ STAT1信號轉導通路，啟動了滑膜增殖和骨質破壞過程。

關節(jié)炎；膠原；大鼠

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritiS，IA）是一種以關節(jié)軟骨和骨質破壞為特點的慢性炎癥性、自身免疫性疾病，其基本病理改變是滑膜炎。膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritiS，CIA）大鼠模型的關節(jié)病理與IA在滑膜增生、細胞浸潤、軟骨侵蝕、骨吸收和重塑等方面極為相似，已經(jīng)成為IA研究的理想動物模型［1，2］。前期研究表明［3］，高遷移率族蛋白1（high mobility group box chromoSomal protein 1，HMGB1）是IA發(fā)病中炎癥信號的重要啟動因素，并與IA病情進展和骨質破壞密切相關，但其誘導IA滑膜增生的機制尚不清楚。因此，本研究選用CIA大鼠進行動物實驗，觀察HMGB1與磷酸化januS激酶（phoSpho-januS kinaSe，p-JAK）2/信號轉導及轉錄活化因子（Signal tranSducer and activator of tranScription，p-STAT）1信號轉錄因子在滑膜組織中的表達變化并分析其相關性，探討其在滑膜增生、軟骨和骨破壞中的作用，為開辟IA治療新途徑提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及分組：II型膠原乳劑的制備［4］將牛Ⅱ型膠原（美國Sigma公司）溶于0.1mol/ L醋酸中，在4℃下攪拌充分溶解，濃度為2mg/mL，置4℃冰箱過夜。再與完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）等體積混合，冰浴下用玻璃攪拌器勻速攪拌，至充分乳化，即乳化液滴入水中無消散，制成Ⅱ型膠原乳劑。

1.2 造模方法［4］及分組：雄性WiStar大鼠30只，S ～12周齡，體質量（160±20）g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級動物室內(nèi)養(yǎng)殖。隨機分成4組，正常對照Ⅰ組和正常對照Ⅱ組（每組6只）；模型Ⅰ組和模型Ⅱ組（每組9只）。適應性喂養(yǎng)7d，第S天進行造模。模型組每只大鼠的尾根部及背部多點皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原乳劑0.2mL初次免疫，第21天腹腔注射乳劑0.2mL作為二次免疫，成模標準參考文獻［4］。正常對照組注射等體積醋酸于相應部位。第2S天股動脈取血處死正常對照Ⅰ組和模型Ⅰ組中已成模大鼠（作為早期關節(jié)炎組）并取材；第49天同法處死正常對照Ⅱ組和模型Ⅱ組中已成模大鼠（作為晚期關節(jié)炎組）。模型Ⅰ組中6只成模，模型Ⅱ組中S只成模，造模成功率77.S%。

1.3 關節(jié)標本采集及制作：沿膝關節(jié)正中縱行切開皮膚及皮下組織，完整剝離滑膜組織，生理鹽水清洗2遍，一并取后肢踝、趾關節(jié)，充分剃去皮毛及肌腱組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定4Sh后，浸于20%乙二胺四乙酸（ethylenSe diaminote traacetic acid，EDTA）脫鈣液中，室溫脫鈣，定期更換脫鈣液，直至標本硬度和肌肉相仿。脫鈣完畢后由踝關節(jié)中間縱行剖開，一半用于流式細胞學檢測，一半用于免疫組織化學檢測。后者和滑膜組織（固定24h）標本均按常規(guī)程序，脫水、透明、石蠟包埋，切片4um，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烤片4Sh備用。

1.4 光鏡下觀察大鼠關節(jié)組織病理學改變：將滑膜組織和已經(jīng)脫鈣處理的關節(jié)標本，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組滑膜組織、軟骨及骨組織形態(tài)學改變。

1.5 免疫組織化學檢測關節(jié)組織中HMGB1、增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達：切片厚4μm，常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗鼠HMGB1抗體（abcom公司）和小鼠抗大鼠PCNA抗體（北京中山生物工程公司）（均1∶100稀釋），二抗分別為與一抗相對應的生物素化IgG（1∶100稀釋），以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，光鏡觀察陽性信號。具體步驟按照說明書進行。

1.6 流式細胞術檢測關節(jié)組織中磷酸化januS激酶（phoSpho-januS kinaSe p-JAK）2/信號轉導及轉錄活化因子（Signal tranSducer and activator of tranScription，p-STAT）、細胞因子信號傳導抑制蛋白1（SuppreSSor of cytokine Signaling，SOCS1）的表達：將標本用網(wǎng)搓法制成單細胞懸液，取單細胞懸液1×106/mL，加入破膜劑，輕微震蕩，孵育15min，離心棄上清；分別加入1∶50稀釋的兔抗大鼠p-JAK2單克隆抗體（abcom公司）、p-STAT1單克隆抗體（Cell Signaling公司）、SOCS1多克隆抗體（Santa Cruz公司）各100μL，室溫孵育30 min，PBS洗滌后加入1∶50羊抗大鼠FITC-IgG二抗工作液100μL，避光室溫孵育30min，PBS洗滌后，流式細胞儀（Beckman Coulter公司）進行檢測。設PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。以熒光指數(shù)（fluoreScence index，F(xiàn)I）表示待測蛋白的相對含量，公式，F(xiàn)I=（樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度）/正常對照樣品平均熒光強度。

1.7 結果判定：免疫組織化學結果判定標準，HMGB1在細胞核內(nèi)、胞漿內(nèi)和（或）細胞膜上出現(xiàn)黃色顆粒者為陽性。PCNA蛋白陽性信號表達于細胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒者為陽性。

1.8 統(tǒng)計學方法：采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析及Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 關節(jié)組織形態(tài)學改變：光鏡下正常對照組大鼠關節(jié)腔滑膜結構清晰，滑膜襯里層細胞呈扁平狀，排列整齊，約1～2層，滑膜內(nèi)無淋巴細胞、漿細胞浸潤，關節(jié)軟骨表面光滑平整，無剝脫現(xiàn)象，軟骨細胞形態(tài)規(guī)則，分布均勻（圖1A）。模型Ⅰ組大鼠滑膜細胞增生腫脹，呈圓形、橢圓形或多角形，滑膜細胞層次增多，排列紊亂；毛細血管增生，炎細胞浸潤。但軟骨及骨質結構尚完整（圖1B）。模型Ⅱ組大鼠滑膜組織顯著增生，排列極度紊亂；襯里下層大量淋巴細胞、單核細胞及漿細胞浸潤，小血管增多（圖1C）；增生的滑膜組織呈絨毛狀，伸向關節(jié)腔深處或向軟骨表面爬行，軟骨細胞排列紊亂，滑膜細胞變性、壞死、甚至剝脫，可見骨質侵蝕及破壞（圖1D）。

圖1 光鏡下大鼠關節(jié)病理學變化A.正常對照組（HE×400）；B.模型Ⅰ組（HE×400）；C.模型Ⅱ組（HE×400）；D.模型Ⅱ組（HE×100）Figure 1 The pathological changeS of articular tiSSueS in different groupSA.Normal control group（HE×400）；B.Model groupⅠ（HE×400）；C.Model groupⅡ（HE×400）；D.Model groupⅡ（HE×100）

2.2 HMGB1蛋白的表達變化：免疫組織化學顯示，正常大鼠滑膜HMGB1位于襯里層和襯里下層滑膜細胞的細胞核，呈深棕色強陽性反應，細胞漿中多為陰性反應，極少數(shù)呈淺黃色弱陽性反應（圖2A）。模型Ⅰ組，滑膜全層細胞、血管內(nèi)皮細胞及部分炎性細胞如淋巴細胞均表達HMGB1蛋白，除胞核呈陽性外，部分細胞胞漿也呈棕黃色陽性（圖2B），但胞外無棕黃色顆粒，血管壁和血管內(nèi)皮細胞胞核和胞漿中均可見大量HMGB1表達（圖2C）。模型Ⅱ組，HMGB1蛋白在滑膜細胞的細胞核呈深棕黃色陽性表達，大部分細胞漿呈黃色至深棕色不等的陽性反應，細胞外基質中可見大量棕黃色陽性顆粒；破損軟骨表面附有大量HMGB1蛋白陽性細胞，細胞漿內(nèi)HMGB1蛋白表達強度明顯增強，深棕黃色顆粒明顯增多（圖2D）。2.3 PCNA蛋白的表達變化：免疫組織化學顯示，正常對照組，滑膜襯里層及襯里下層散在滑膜細胞的胞核內(nèi)可見棕黃色陽性顆粒，軟骨細胞、血管內(nèi)皮細胞均呈陰性表達（圖3A）；模型Ⅰ組，滑膜襯里層及襯里下層陽性細胞數(shù)目增加，軟骨細胞胞漿中尚未見陽性反應（圖3B）；模型Ⅱ組，大量PCNA蛋白表達陽性的滑膜細胞覆蓋于軟骨表面，并向軟骨下侵蝕，浸潤的炎細胞胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒，少數(shù)受損的軟骨細胞內(nèi)可見淡黃色陽性顆粒（圖3C）。

圖2 HMGB1蛋白表達（IHC×400）A.正常對照組；B.模型Ⅰ組；C.模型Ⅰ組；D.模型Ⅱ組Figure 2 The expreSSion of HMGB1 protein in the Synovium detected（IHC×400）A.Normal control group；B.Model groupⅠ；C.Model groupⅠ；D.Model groupⅡ

圖3 PCNA蛋白表達（IHC×400）A.正常對照組；B.模型Ⅰ組；C.模型Ⅱ組Figure 3 The expreSSion of PCNA protein in the Synovium detected（IHC×400）A.Normal control group；B.Model groupⅠ；C.Model groupⅡ

2.4 p-JAK2蛋白的表達變化：流式細胞術顯示，與正常對照組相比，模型Ⅰ組p-JAK2蛋白表達增加（P＜0.05），但隨著關節(jié)病變加重，p-JAK2蛋白表達顯著減少，與模型Ⅰ組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

2.5 p-STAT1蛋白的表達變化：流式細胞術顯示，與正常對照組相比，2模型組p-STAT1蛋白表達均顯著增加（P＜0.01）；模型Ⅱ組p-STAT1較模型Ⅰ組表達減少，但差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.6 SOCS1蛋白的表達變化：流式細胞術顯示，與正常對照組相比，2模型組SOCS1蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；模型Ⅱ組SOCS1蛋白表達較模型Ⅰ組明顯減少（P＜0.01），見表1。

表1 流式細胞術檢測p-JAK2/p-STAT1/ SOCS1蛋白表達Table 1 The expression of p-JAK2/p-STAT1/SOCS1 proteins by FCM （n=6，±s）

表1 流式細胞術檢測p-JAK2/p-STAT1/ SOCS1蛋白表達Table 1 The expression of p-JAK2/p-STAT1/SOCS1 proteins by FCM （n=6，±s）

*P＜0.01 vs normal control group #P＜0.01 vs model group 1 by t teSt

n p-JAK2p-STAT1SOCS1 Normal control groupⅠ61.00±0.061.00±0.051.00±0.09 Model groupⅠ61.21±0.06*1.35±0.10*1.31±0.06*Normal control groupⅡ61.00±0.091.00±0.091.00±0.0S Model groupⅡS1.07±0.07#1.2S±0.0S#1.16±0.07*#

2.7 相關性分析：p-STAT1與HMGB1、PCNA的表達呈顯著正相關（r=0.474，P=0.014；r=0.529，P=0.005）。p-JAK2與HMGB1無相關性（r= 0.222，P=0.276）。

3 討 論

本實驗采用通過牛Ⅱ型膠原聯(lián)合弗氏完全佐劑誘發(fā)大鼠免疫反應，成功誘導了CIA動物模型，造模成功率在70%以上。在光鏡下，可以清晰觀察到大鼠關節(jié)組織學病變進展過程，從輕度滑膜增厚、炎細胞浸潤到血管翳形成并向軟骨表面及骨組織浸潤，最終引起軟骨和骨質破壞，該形態(tài)學變化酷似IA病理改變。

本研究采用免疫組織化學法檢測了HMGB1在滑膜組織中的定位表達強度。結果顯示，HMGB1主要分布于正常大鼠滑膜襯里層和襯里下層滑膜細胞的細胞核中，極少量表達于胞漿，說明在正常滑膜組織中，HMGB1是一種典型的DNA結合蛋白，承擔著“DNA伴侶”作用，在DNA修復、重組、細胞分化中起著重要作用［5］；而CIA模型組中，隨著關節(jié)病變進行性發(fā)展，HMGB1在滑膜細胞、浸潤炎細胞的細胞核表達增多，并轉移至細胞質和細胞外基質中，這一現(xiàn)象說明滑膜細胞具有自主合成和釋放HMGB1蛋白的功能，而且HMGB1表達的移位與其發(fā)揮致炎作用密切相關［6］，這種變化在新生血管的內(nèi)皮細胞中也體現(xiàn)出來，推測HMGB1可能是促進滑膜炎中血管內(nèi)皮細胞的增殖和微血管的形成重要炎癥介質。伴隨著HMGB1蛋白表達的增加，與反應細胞增殖的生物學指標——PCNA水平也顯著增加，推測HMGB1在促進滑膜組織增生中發(fā)揮了重要的作用。

JAK/STAT信號途徑是細胞因子信號轉導的重要通路之一，JAKS家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，STATS是JAKS激酶的底物，能與DNA結合的蛋白家族，與酪氨酸磷酸化信號通路耦聯(lián)，發(fā)揮轉錄調(diào)控作用。非磷酸化的STATS蛋白以單體形式存在，而其磷酸化以后則以二聚體形式存在。STATS二聚體可轉移到核內(nèi)，結合于啟動子區(qū)的相關序列，從而調(diào)控下游基因表達［7］。已有研究表明［8］，p-STAT1能夠誘導人類白細胞相關抗原、協(xié)同刺激因子、趨化因子、補體等炎癥相關基因的表達，促進炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展的作用；本研究顯示模型組p -STAT1蛋白表達均顯著增加，并與PCNA的表達呈正相關，說明STAT1在滑膜炎癥反應和增殖中發(fā)揮了重要作用，其機制可能與STAT1通過酪氨酸和（或）絲氨酸磷酸化，進一步促進細胞的生長和細胞周期進程有關［9］。另外，模型組p-STAT1水平與HMGB1的表達亦呈正相關，推測HMGB1在促進滑膜組織增生過程中可能啟動了STAT1信號通路，但需進一步通過細胞培養(yǎng)方法進一步證實。

信號傳導抑制蛋白（SuppreSSor of cytokine Signaling，SOCS）家族是JAK/STAT信號轉導過程的負性調(diào)節(jié)因子［10］。本研究表明，在早期CIA大鼠關節(jié)組織中，p-JAK2、p-STAT1蛋白表達顯著增高，反饋性引起其負性調(diào)節(jié)蛋白SOCS1表達也增加；SOCS與STATS競爭性結合JAKS的磷酸化位點，使p-STATS表達下降，阻斷其信號傳遞功能［11］。在關節(jié)炎晚期病變中，p-JAK2顯著下降，而p-STAT1持續(xù)處于較高活化狀態(tài)，隨著p-STAT1表達持續(xù)增強，SOCS1表達減弱，二者協(xié)同作用促進滑膜細胞的增生。

總之，HMGB1參與了IA發(fā)病過程中的滑膜細胞增生、骨質吸收、破壞等病理過程；并可能通過上調(diào)STAT1/SOCS1信號轉導蛋白表達，介導IA的發(fā)生和發(fā)展。p-JAK2可能激活了STAT1信號轉導的啟動過程，但并不伴隨關節(jié)炎進展的全部病程。

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CORRELATION OF HMGB1 AND JAK2/STAT1 SIGNAL TRANSDUCTION PROCESS IN THE RAT MODEL OF COLLAGEN INDUCED ARTHRITIS

ZHANG Ming-feng1，ZHOU Shou-qin2，BAI Lian-xing3，GUO Hui-fang1*，GAO Li-xia1，MA Li-yan1
（1.Department of Rheumatology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Clinical Laboratory，Tangshan Steel Corporation General Hospital，Hebei Province，Tangshan 063020，China；3.Deprtment of Geriatrics，the Fifth Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde 067500，China）

ObjectiveTo inveStigate the regulating effect of high mobility group box（HMGB）1 on phoSpho-januS kinaSe2/Signal tranSducer and activator of tranScription 1（p-JAK2/STAT1）Signal tranSduction proceSS in the rat model of collagen induced arthritiS（CIA）.MethodsAll 30 male WiStar ratS were divided randomly into four groupS，two control groupS（each including 6 ratS）and two model groupS（each including 9 ratS）.Type II collagen（CII）waS prepared for eStabliShing CIA modelS.HE Staining waS uSed to obServe the pathological changeS of rat joint Structure.The expreSSion of HMGB1 and proliferation cell nuclear antigen（PCNA）proteinS in Synovium and articular tiSSueS were analyzed by immunohiStochemiStry（IHC）.Flow cytometric analySiS（FCM）waS performed to detect the expreSSion of p-JAK2，p-STAT1，SuppreSSor of cytokine Signaling（SOCS）1 proteinS of articular tiSSueS.ResultsSpecimenS from model groupS diSplayed a Strong deStruction with Synoviocyte proliferation，inflammatorycellS infiltration，even accompanied by cartilage or bone eroSion.IHC Staining revealed that HMGB1 protein expreSSion Significantly increaSed in the nuclei，cytoplaSm and extracellular matrix，and poSitive expreSSion cellS of PCNA increaSed too.Compared with normal control group，p-JAK2，p-STAT1，SOCS1 protein expreSSion markedly increaSed in model groupⅠ（P＜0.01）.But compared with in model groupⅠ，the expreSSion of p-JAK2 and SOCS1 decreaSed，p-STAT1 protein had no StatiStical change in model groupⅡ.There were poSitive correlation between p-STAT1 and HMGB1，PCNA proteinS expreSSion（r=0.474，P=0.014；r=0.529，P=0.005）.ConclusionHMGB1 playS an important role in promoting SynovicyteS proliferation and bone deStruction of CIA ratS by activating JAK2/STAT1 Signal tranSduction proceSS.

arthritiS；collagen；ratS

I361.3

A

1007-3205（2011）07-0750-05

2011-03-30；

2011-06-03

河北省科技廳科技攻關基金資助項目（0S206122D）

張明峰（1972-），男，河北巨鹿人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事風濕免疫病基礎和臨床研究。

*通訊作者。E-mail：guohfch@Sina.com

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.003