趨化因子受體CXCR4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

叢璐璐，胡紅超，焦保華

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

趨化因子受體CXCR4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

叢璐璐，胡紅超，焦保華*

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

目的觀察CXCI4在正常腦組織及各級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，探討其與膠質(zhì)瘤的侵襲性、病理級(jí)別及血管生成的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法測定5例正常腦組織及3S例膠質(zhì)瘤組織中CXCI4、CD34的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCI法測定CXCI4mINA的相對表達(dá)量。結(jié)果CXCI4在正常腦組織中陰性表達(dá)，膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)率為63.16%，各病理級(jí)別組的陽性表達(dá)率及相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且均隨級(jí)別增加而升高；CD34單克隆抗體標(biāo)記的微血管密度（microveSSel denSity，MVD）在正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)均值分別為3.76±0.4S和35.25±9.75，在各級(jí)別組中的表達(dá)均值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）并隨級(jí)別增加而升高；MVD在CXCI4表達(dá)陰性和陽性的膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)均值分別為26.37±5.11和40.43±7.SS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論CXCI4與膠質(zhì)瘤的侵襲性及惡性程度有關(guān)并可能參與膠質(zhì)瘤的新生血管生成；MVD可作為判定腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。

受體，趨化因子；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；免疫組織化學(xué)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具體發(fā)生機(jī)制不清，傳統(tǒng)的治療方法效果不佳。趨化因子受體CXCI4屬于G蛋白偶聯(lián)受體（Gproteincoupled receptor，GPCI）超家族成員，研究表明［1］CXCI4在多種腫瘤中表達(dá)，特異性封閉CXCI4可抑制成瘤率。因此研究CXCI4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系，對于探究以趨化因子受體為靶點(diǎn)的治療策略具有十分重要的意義。本研究旨在通過研究趨化因子受體CXCI4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤各病理級(jí)別中的表達(dá)情況，來分析其表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲性的內(nèi)在關(guān)系及其與微血管密度（microveSSel denSity，MVD）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標(biāo)本來源于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科2009年10月—2010年3月經(jīng)手術(shù)切除的資料完整的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)標(biāo)本3S例，其中男性22例，女性16例，年齡4～62歲，平均（46.12±17.13）歲。所有患者均為首發(fā)病例，術(shù)前未行放化療等治療手段，所有組織均行病理組織學(xué)檢查確診，并按照WHO腦腫瘤分類、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床病理分級(jí)。其中Ⅱ級(jí)1S例，Ⅲ級(jí)12例，Ⅳ級(jí)S例。為了方便統(tǒng)計(jì)，將Ⅱ級(jí)歸為低級(jí)別組，Ⅲ～Ⅳ級(jí)歸為高級(jí)別組。另取5例需行顱內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織標(biāo)本作為對照，男性4例，女性1例，年齡26～65歲，平均（4S.S0±14.S2）歲。

1.2 主要試劑：兔抗人CXCI4單克隆抗體購自美國EPITOMICS公司，按1∶100稀釋備用；鼠抗人原始造血細(xì)胞（CD34）單克隆抗體工作液及濃縮型DAB試劑購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；兔免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；小鼠SP染色試劑盒購自美國ZYMED公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；PCI引物及β-action由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1.1 腫瘤組織HE染色及免疫組織化學(xué)染色：標(biāo)本以4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，先行HE染色，然后按試劑盒說明書進(jìn)行SP法免疫組織化學(xué)染色，微波爐熱修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.1.2 結(jié)果判定：①CXCI4結(jié)果判定，CXCI4免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞胞膜及細(xì)胞漿，核不著色。參考相關(guān)文獻(xiàn)［2］采用陽性細(xì)胞百分比結(jié)合顯色強(qiáng)度法判讀結(jié)果。②MVD的測定，參照Weidner［3］報(bào)道的方法進(jìn)行測定，瘤組織內(nèi)任何被抗CD34抗體染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，有或無管腔，只要與其他組織成分有明顯區(qū)別，均計(jì)為1個(gè)陽性血管標(biāo)記，避開腫瘤壞死或出血區(qū)域，計(jì)算MVD測定值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCI實(shí)驗(yàn)步驟：無菌操作下收集新鮮組織迅速凍存于-S0℃冰箱，以Trizol試劑按照說明書提取組織總INA，進(jìn)行INA濃度、純度和完整性測定。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為，37℃15 min；S5℃5S。熒光定量PCI檢測目的基因的相對表達(dá)，依參考文獻(xiàn)［4］，目的基因的引物序列及擴(kuò)增片段長度如下，CXCI4上游引物，5ˊ-AATCTTC CTGCCCACCATCT-3ˊ，下游引物，5ˊ-GACGCCAACATAGACCACCT-3ˊ，擴(kuò)增片段長度367bp。β-actin上游引物，5ˊ-GGACTTCGAGCAAGA GATGG-3ˊ，下游引物，5ˊ-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3ˊ，擴(kuò)增片段長度220bp。擴(kuò)增條件為，95℃10 min，40個(gè)循環(huán)（95℃15S，60℃1min）。PCI產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，以β-actin作為內(nèi)參基因，△△Ct法分析基因的相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或tˊ檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 趨化因子受體CXCI4在蛋白水平的表達(dá)（圖1，2）：CXCI4在正常腦組織中表達(dá)陰性，在24例膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)呈陽性，總陽性表達(dá)率為63.16%，在低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組的陽性表達(dá)率分別為44.44%、S0.00%。CXCI4陽性表達(dá)率隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而呈上升趨勢，且高級(jí)別組CXCI4的陽性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 CXCR4在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)Table 1 The expression of CXCR4 in normal brain and gliomas （n）

2.2 趨化因子受體CXCI4mINA的相對表達(dá)量：CXCI4mINA在低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的相對表達(dá)量分別為2.22±0.S0和4.03±1.9S，其趨勢為隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 CXCR4 mRNA在腦膠質(zhì)瘤中的相對表達(dá)量Table 2 The relative expression of CXCR4mRNA in gliomas （±s）

表2 CXCR4 mRNA在腦膠質(zhì)瘤中的相對表達(dá)量Table 2 The relative expression of CXCR4mRNA in gliomas （±s）

GroupSnCXCI4mINA relative expreSSiont’P Low differentiated1S2.22±0.S0 High differentiated204.03±1.9S -3.7S＜0.05

2.3 以CD34單克隆抗體標(biāo)記的MVD測定結(jié)果（圖3，4）：MVD在正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)均值分別為3.76±0.4S和35.25±9.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MVD在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)均值分別為27.3S±5.04 和42.34±7.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 MVD在膠質(zhì)瘤組和正常腦組織中的測定值Table 3 MVD in gliomas and normal brain tissue （±s）

表3 MVD在膠質(zhì)瘤組和正常腦組織中的測定值Table 3 MVD in gliomas and normal brain tissue （±s）

MVD：microveSSel denSity

GroupSnMVDt（tˊ）P Normal brain53.76±0.4S GliomaS3S35.25±9.75-19.74＜0.01 Low differentiated（Ⅱ）1S27.3S±5.04 High differentiated（Ⅲ、Ⅳ）2042.34±7.12-7.40＜0.01

2.4 CXCI4的表達(dá)與MVD的關(guān)系：MVD在14例CXCI4表達(dá)陰性的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)均值為26.37±5.11，在24例CXCI4表達(dá)陽性的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)均值為40.43±7.SS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4。

表4 CXCR4的表達(dá)與MVD值的關(guān)系Table 4 The correlation between expression of CXCR4 and MVD （±s）

表4 CXCR4的表達(dá)與MVD值的關(guān)系Table 4 The correlation between expression of CXCR4 and MVD （±s）

CXCI4nMVDt’P -1426.37±5.11+～++2440.43±7.SS -6.66＜0.01

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)等生物學(xué)特性［5］。腫瘤區(qū)域有許多重要的神經(jīng)功能要進(jìn)行保護(hù)，因此傳統(tǒng)的手術(shù)切除幾乎無法切除所有的腫瘤細(xì)胞，術(shù)后復(fù)發(fā)快、預(yù)后差。隨著對神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究以及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子靶向治療逐漸成為一種具有廣闊前景的治療新手段。

趨化因子是一類對免疫細(xì)胞起趨化作用的促炎因子，它們能使細(xì)胞沿著濃度梯度朝高濃度刺激物的方向發(fā)生定向移動(dòng)。根據(jù)其形成的二硫鍵的4個(gè)保守半胱氨酸的位置可分為4類，CC趨化因子、CXC趨化因子、CX3C趨化因子和C趨化因子。趨化因子只有與靶細(xì)胞上相應(yīng)的特定受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，參與機(jī)體的各種生理病理反應(yīng)。

趨化因子受體屬于GPCI超家族，是一種特殊的G蛋白，均含有7個(gè)跨膜區(qū)域，通過與G蛋白相關(guān)聯(lián)來介導(dǎo)趨化因子對其靶細(xì)胞的特異效應(yīng)。趨化因子受體根據(jù)結(jié)合配體的不同也可相應(yīng)的分為四類，CXCI，CCI，XCI和CX3CI，其中以CXCI與腫瘤血管生成的關(guān)系最為密切［6］，CXCI4可能參與了促血管生成的作用。

我們通過免疫組織化學(xué)染色法對膠質(zhì)瘤組織中CXCI4的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CXCI4在5例正常腦組織中表達(dá)陰性，而在3S例腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)率為63.16%，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)率較低級(jí)別的表達(dá)率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCI實(shí)驗(yàn)方法測定趨化因子受體CXCI4mINA的相對表達(dá)量，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果具有一致性。從蛋白和分子水平同時(shí)證實(shí)了CXCI4在膠質(zhì)瘤中是有功能性的，其表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)、侵襲性有關(guān)系，并且可能CXCI4表達(dá)陽性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞是更具侵襲能力的亞群，且惡性程度較高。

血管生成是指在原有血管基礎(chǔ)上的新生血管生成，其過程的核心是取決于血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和凋亡平衡的結(jié)果。腫瘤以異常增生為特點(diǎn)，而過度增生的腫瘤組織需要更多的營養(yǎng)，必然會(huì)有新生血管的生成才能滿足腫瘤生長所需的營養(yǎng)。實(shí)體腫瘤若無新生血管，僅能自發(fā)生長至直徑2mm體積，此為周邊血管物質(zhì)滲透范圍所及，其繼續(xù)生長則有賴于新生血管生成［9］。當(dāng)實(shí)體腫瘤直徑＞2mm后，其生長就必須依靠新生血管為其提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧，排除代謝廢物，并為腫瘤細(xì)胞的播散提供最直接的通道，尤其是惡性實(shí)體腫瘤的生長必須依賴新生血管持續(xù)不斷地為其提供營養(yǎng)和排除代謝產(chǎn)物。

腫瘤組織誘導(dǎo)的血管生成不僅為實(shí)體腫瘤的后續(xù)生長及轉(zhuǎn)移提供了生物物質(zhì)基礎(chǔ)，而且腫瘤血管生成的本身具有一定侵襲性，瘤細(xì)胞可沿由新生血管開啟的組織裂隙，向外侵襲周圍組織。而腫瘤微血管在病理生理、形態(tài)功能方面的特征性，也為腫瘤細(xì)胞成功逃避機(jī)體免疫監(jiān)測和細(xì)胞毒性藥物的化療提供了"屏障"基礎(chǔ)；總之，血管生成與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及預(yù)后有著密切的關(guān)系。

一般認(rèn)為，腫瘤的MVD既可作為反映血管生成程度的指標(biāo)，又可作為反映膠質(zhì)瘤預(yù)后的一項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)。而CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物中較敏感的指標(biāo)，其在新生血管內(nèi)皮中的表達(dá)遠(yuǎn)大于非新生血管內(nèi)皮。

因此本文利用抗內(nèi)皮細(xì)胞CD34單抗來標(biāo)記正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的微血管，從而對其進(jìn)行計(jì)數(shù)來測定MVD值。結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的MVD值顯著高于正常腦組織，并且高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的MVD值較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著增加，表明低惡性度膠質(zhì)瘤的MVD偏低可能同分化較好的腫瘤細(xì)胞能對原有血管充分利用有關(guān)，腫瘤細(xì)胞在向外生長過程中，血管新生是同步進(jìn)行的，新生血管化程度與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。因此我們可以認(rèn)為MVD可作為反映膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo)。

近年來，趨化因子及其受體在腫瘤血管生成中的作用及機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。趨化因子對腫瘤的血管生成的調(diào)節(jié)具有刺激生成和抑制增生雙向作用，兩者之間的平衡決定著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。已有研究［10］顯示CXCI4可能參與了促血管生成作用，膠質(zhì)瘤細(xì)胞所表達(dá)的CXCI4是功能性的，活化后可能通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)在CXCI4介導(dǎo)膠質(zhì)瘤侵襲和血管生成上起重要作用，并且CXCI4的活化可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的合成增加。

本結(jié)果提示CXCI4可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性程度及侵襲性有關(guān)，而且還可能與血管生成有關(guān)，結(jié)果顯示代表膠質(zhì)瘤血管生成情況的MVD值在趨化因子受體CXCI4表達(dá)陰性和陽性的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示CXCI4可能參與膠質(zhì)瘤的新生血管生成。

綜上所述，趨化因子受體CXCI4與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及血管生成密切相關(guān)。深入研究CXCI4受體的功能和作用機(jī)制將為腫瘤的綜合治療提供理論和實(shí)踐的指導(dǎo)意義，并且CXCI4可作為臨床判斷膠質(zhì)瘤侵襲性的輔助指標(biāo)及預(yù)后指標(biāo)，指導(dǎo)臨床醫(yī)生采取更有效的術(shù)后輔助治療。（本文圖見封二）

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EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF CHEMOKINE RECEPTOR CXCR4 IN GLIOMA

CONG Lu-lu，HU Hong-chao，JIAO Bao-hua*
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo obServe the expreSSion of CXCI4 in normal brain tiSSue and all grade gliomaS，analyze the internal relationS between the expreSSion of chemokineS receptorS CXCI4 and invaSiveneSS of glioma，pathological grade and angiogeneSiS.MethodsThe expreSSion of CXCI4 protein and CD34 were examined by immunohiStochemiStry in 5 normal brain tiSSue SpecimenS and 3S glioma tiSSue SpecimenS，the relative expreSSion of chemokineS receptorS CXCI4 waS detected in glioma tiSSue Specimen by quantitative real-time PCI.ResultsThe chemokineS receptorS CXCI4 waS negatively expreSSed in normal brain tiSSueS，the total poSitive expreSSion rateS in tumor group waS 63.16%，the poSitive expreSSion rateS and the relative expreSSion of CXCI4 haS Significant difference between different grade gliomaS（P＜0.05），and increaSed with the pathological grade of glioma；the CD34 monoclonal antibody-labeled-microveSSel denSity（MVD）in normal brain tiSSue group and tumor group reSpectively were 3.76±0.4S and 35.25±9.75，the value had Significant difference between different grade gliomaS（P＜0.01），and increaSed with the pathological grade of glioma；The expreSSion average of MVD reSpectively were 26.37±5.11and 40.43±7.SS in negative expreSSion and poSitive expreSSion of CXCI4 in glioma tiSSueS，the data had very Significant difference（P＜0.01）.ConclusionCXCI4 iS related to the invaSiveneSS and the malignancy of glioma，and might take part in the angiogeneSiS of glioma；MVD can be uSed aS an important indicator of determining malignancy and prognoSiS of tumor.

recepterS，chemokine；glioma；immunohiStochemiStry

I739.41

A

1007-3205（2011）07-0770-04

2011-04-2S；

2011-06-20

叢璐璐（19S4-），女，山東文登人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事腦膠質(zhì)瘤診斷與治療研究。

*通訊作者

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.010