Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡和線粒體跨膜電位損傷關(guān)系研究＊

張紅 劉劍 秦大蓮,2 章卓,2△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室,四川 瀘州 646000;2.藥品與功能食品研究中心,四川 瀘州 646000)

隨著老齡社會的到來,阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者越來越多。AD為慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病,以認(rèn)知功能和記憶損害、日常生活能力進(jìn)行性下降、神經(jīng)心理癥狀和精神行為異常為主要特征。由于其涉及機(jī)制復(fù)雜,目前尚無有效手段治療。β-淀粉樣蛋白異常沉積、細(xì)胞凋亡在AD的發(fā)病中起著重要作用,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)由 39-43個(gè)氨基酸組成,相對分子質(zhì)量約為(4.0-4.2)×103,聚集態(tài)的Aβ25-35可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡,損傷神經(jīng)細(xì)胞[1]。目前各實(shí)驗(yàn)室對Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡的最適濃度與最適時(shí)間各有不同,對Aβ25-35致 PC12細(xì)胞凋亡原因是否與改變線粒體跨膜電位有關(guān)也未見研究,據(jù)此本研究通過采用不同濃度的Aβ25-35在不同時(shí)間誘導(dǎo)PC細(xì)胞凋亡,確定Aβ25-35誘導(dǎo)PC細(xì)胞凋亡的最適濃度和最佳時(shí)間,并進(jìn)一步分析其凋亡和線粒體跨膜電位(M TP)改變間關(guān)系,為建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型,進(jìn)一步闡明阿爾茨海默病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Aβ25-35(北京奧普森有限公司);PC12細(xì)胞(購自武漢大學(xué)CCTCC細(xì)胞庫);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Keygen公司,批號 20101202);Hoechst 33342以及 PI(Sigma,USA);DM EM/F12培養(yǎng)基,胎牛血清,馬血清(天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司,CKX41型);CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司,M CO-15AC型);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司,SW-CJ-1F型);離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠,LG10-3A型);電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司,FA1104N型);超低溫冰箱(日本Sanyo公司,MDF-192型);高壓消毒鍋(上海申安醫(yī)療器械廠,LDZX-40BI型);酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司,DNM-9602型);優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司,UPH-IV-10T型);激光共聚焦掃描顯微鏡(德國LEICA公司,TCS SP5型)。流式細(xì)胞儀(美國 BD公司,SBK-YLQX-003552型)。

1.3 Aβ25-35配制方法

將 Aβ25-35溶于超凈水,配成16000μmol? L-1母液分裝,-20℃凍存,使用前于37℃孵育 1 w,使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。

1.4 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組

PC-12細(xì)胞株完全培養(yǎng)液為 DM EM+5%胎牛血清+10%馬血清+青鏈霉素,培養(yǎng)瓶多聚賴氨酸鋪底,5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。分組：①陰性組：不加任何處理因素。②實(shí)驗(yàn)組：Aβ25-35按160,80,40,20,10,5,2.5μ mol?L-17個(gè)濃度進(jìn)行處理,處理時(shí)間按6,12,24 h進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞,0.25%胰酶制成單個(gè)細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為1×105?L-1接種于 96孔板,每孔90 μ l,培養(yǎng)24 h待其貼壁后加藥。每孔加Aβ25-3510 μ l,每個(gè)濃度 4個(gè)復(fù)孔,Aβ25-35 終濃度分別為 160,80,40,20,10,5,2.5μmol?L-1,陰性組加等體積無血清 RPMI 1640,繼續(xù)培養(yǎng)6,12,24 h后,每孔加入CCK-810μ l繼續(xù)培養(yǎng)1 h,酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值,以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力情況。

1.6 Annexin V-FITC流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡

PC12細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.5。消化收集細(xì)胞,用冷PBS洗兩次,將細(xì)胞懸浮于AnnexinV混合緩沖液中(1×106?ml-1),取 100 μ l細(xì) 胞 懸液 至 EP 管 中,加 5 μ l Armexin-FITC和5 μ l PI,輕輕振搖細(xì)胞,室溫下于暗處放置15min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 Hochest33342/PI雙染檢測PC12細(xì)胞凋亡

PC12細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.5。收集細(xì)胞懸浮于1mL培養(yǎng)基中,加入 10 μ l Hochest 33342儲存液(100 mg? L-1,蒸餾水溶解),染色15min;將細(xì)胞置于冰上冷卻后,離心,去上清,將細(xì)胞重懸于 1ml PBS中,加人5 μ l PI儲存液(1 g?L-1,蒸餾水溶解),混勻,熒光顯微鏡觀察。

1.8 羅丹明染色檢測線粒體跨膜電位

將不同處理后的 PC12細(xì)胞用 0.25%胰酶消化,收集1×l06個(gè)細(xì)胞,經(jīng) PBS 清洗 2 次,與 1μmol?L-1Rh123 在37℃共同孵育30min,PBS清洗2次,熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Aβ25-35在不同處理時(shí)間對 PC12細(xì)胞活力影響

同陰性對照組比較,Aβ25-35處理 6 h僅 160,80μmol?L-12個(gè)濃度組有差異,Aβ25-35處理 12 h和 24 h,Aβ25-3520μ mol?L-1以 上 組 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 (P＜0.05),10μ mol?L-1以下組處理 6,12,24 h后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖 1。

圖1 A β25-35不同濃度和不同處理時(shí)間對PC 12細(xì)胞活力影響

2.2 不同濃度Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞12 h后凋亡率的變化

將流式細(xì)胞檢測的早期凋亡率與晚期凋亡率相加得到凋亡率。結(jié)果顯示,與陰性組比較,Aβ25-3520μmol?L-1以上組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但 160,80μmol?L-1晚期凋亡較多,見圖 2。

圖2 不同濃度 A β25-35刺激PC 12細(xì)胞12 h后凋亡率影響

2.3 不同濃度Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞12 h后細(xì)胞形態(tài)變化

Hochest 33342/PI雙染顯示,陰性對照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形,淡藍(lán)色,無凋亡細(xì)胞。Aβ25-3520μmol? L-1以上組細(xì)胞部分呈凋亡特征性改變,細(xì)胞核呈亮藍(lán)色染色,凋亡細(xì)胞較多。還可見死亡細(xì)胞(紅色),160,80μmol?L-1組死亡細(xì)胞多于其他各組,見圖3。

圖3 不同濃度A β25-35刺激PC 12細(xì)胞12 h后凋亡影響

2.5 對線粒體跨膜電位影響

熒光顯微鏡結(jié)果顯示,Aβ25-3520μmol?L-1以上組細(xì)胞熒光較強(qiáng),線粒體跨膜電位降低。提示 Aβ25-3520μmol?L-1以上濃度可降低PC12細(xì)胞線粒體跨膜電位,與凋亡程度呈正相關(guān),見圖4。

圖4 不同濃度 A β25-35刺激12 h對PC 12細(xì)胞線粒體跨膜電位影響

3 討論

Aβ25-35具有與Aβ全長片段相同的功能,研究顯示聚集態(tài)的Aβ25-35對神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用,此作用可能與激活細(xì)胞外磷脂激酶A2依賴的信號調(diào)節(jié)途徑刺激ROS產(chǎn)物的生成損傷細(xì)胞器和細(xì)胞骨架有關(guān);還可能通過影響 PI3K/Akt、JNK-CJun-FasL-Fas等信號通路導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2]。

線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對稱分布造成線粒體跨膜電位(△ψm)。正常生理情況下,線粒體內(nèi)膜通透性很低,僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過,對離子(包括質(zhì)子)幾乎不能透過內(nèi)膜,某些大分子和離子要通過選擇性通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白才能通過內(nèi)膜。內(nèi)膜的低通透性是維持電化學(xué)質(zhì)子梯度、進(jìn)行氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrialpermeability transition pore,MPTP)開放致線粒體內(nèi)膜通透性改變(Permeability transition,PT),線粒體內(nèi)膜允許分子量115kDa的分子自由通過[3]。在細(xì)胞凋亡早期,線粒體外膜對蛋白質(zhì)的通透性增高,線粒體內(nèi)膜的跨膜潛能降低。當(dāng)線粒體膜內(nèi)外的電勢差減少時(shí).線粒體膜電位降低,可引起線粒體膜內(nèi)外一系列的生化改變,如釋放具有調(diào)控能量代謝和細(xì)胞凋亡雙重功能的Bcl-2家族及Caspase活化等,引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng).最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。羅丹明123(Rhodamine 123)是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料,其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,Rh123重新釋放出線粒體,從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)選擇羅丹明染色后熒光顯微鏡檢測線粒體跨膜電位。

PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞克隆化的細(xì)胞株,具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特性,它廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)細(xì)胞分化、神經(jīng)毒性等試驗(yàn)。因此不少實(shí)驗(yàn)室通過Aβ25-35刺激PC12細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型,但目前各實(shí)驗(yàn)室對Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡的最適濃度與最適時(shí)間各有不同[5],對Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡原因是否與改變線粒體跨膜電位有關(guān)也未見研究,據(jù)此本實(shí)驗(yàn)室通過采用160,80,40,20,10,5,2.5μ mol?L-17個(gè)濃度的Aβ25-35在6,12,24h誘導(dǎo)PC細(xì)胞凋亡,確定Aβ25-35誘導(dǎo)PC細(xì)胞凋亡的最適濃度和最佳時(shí)間,并進(jìn)一步分析其凋亡和線粒體跨膜電位改變間關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同正常組比較,Aβ25-3520μ mol?L-1以上濃度組刺激12 h即可出現(xiàn)細(xì)胞活力明顯下降,凋亡率明顯增加(P＜0.05),但160,80μmol?L-1晚期凋亡較多。熒光顯微鏡顯示細(xì)胞有核濃縮和凋亡小體的產(chǎn)生,甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,160,80μmol?L-1組死亡細(xì)胞多于其他各組。線粒體跨膜電位降低,與凋亡程度呈正相關(guān)。20μmol?L-1以下各濃度組對PC12細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、線粒體跨膜電位無明顯影響(P＞0.05)。

因此本實(shí)驗(yàn)綜合凋亡結(jié)果、經(jīng)濟(jì)性、時(shí)間等多種因素認(rèn)為,20μ mol?L-1刺激12 h即可得到理想的 PC12細(xì)胞凋亡模型,既省錢又省時(shí),為建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型,進(jìn)一步闡明阿爾茨海默病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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