梯度洗脫高效液相色譜法檢測注射用替加環(huán)素的有關物質

謝安云，徐潔昵，陳麗華

替加環(huán)素(Tigecycline，商品名:Tygacil)為甘氨酰環(huán)素類抗生素，其結構與四環(huán)素類藥物相似，具有超廣譜抗菌活性，對革蘭陽性和革蘭陰性需氧菌、非典型致病菌以及厭氧性細菌，特別是對耐藥致病菌(如 MRSA、PRSP、VRE)和對糖肽類抗生素敏感性降低的葡萄球菌均具有很高的活性。此外，替加環(huán)素對產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌，以及包括大部分脆弱擬桿菌在內的多數腸桿菌屬也具有活性［1-2］。根據替加環(huán)素的合成工藝，本品中可能存在的雜質主要有反應初始物米諾環(huán)素、中間體9-氨基米諾環(huán)素、9-硝基米諾環(huán)素以及反應副產物4-差向相異構體。通過結構分析，替加環(huán)素與9-氨基米諾環(huán)素、4-差向相異構體的極性相對接近，而與米諾環(huán)素、9-硝基米諾環(huán)素的極性差異較大，采用一般的等強度洗脫難以實現(xiàn)各中間體及主峰的同時分離，故本文選用梯度洗脫方式，對本品有關物質檢查，并進行方法學研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀(515泵，2487檢測器，7725i手動進樣器);大連依利特EC2000色譜數據工作站及泵控系統(tǒng);大連依利特ZW柱溫箱;北京通用TU1810紫外-可見分光光度計;Mettler AE100電子分析天平;Gemini C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱。

1.2 試藥 乙腈(色譜純，Caledon Laboratories LTD)、磷酸氫二鉀、亞硫酸氫鈉、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉(分析純，湖南師大化學試劑廠);水(樂百氏純水);注射用替加環(huán)素(批號:100401、100402、100403，由長沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)、9-氨基米諾環(huán)素(HPLC純度＞95%，由長沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)、鹽酸米諾環(huán)素(HPLC純度＞98%，重慶萊美藥業(yè)有限公司提供)、替加環(huán)素對照品(批號:090908，純度:99.5%，由長沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Waters C18(5 μm，416 mm×250 mm);流動相:以磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4.35 g、乙二胺四乙酸二鈉0.93 g，加水950 mL溶解，并用磷酸調節(jié)pH值至6.4)-乙腈(95∶5)為流動相A，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4.35 g、乙二胺四乙酸二鈉0.93 g，加水500 mL溶解，并用磷酸調節(jié)pH值至6.4)-乙腈(5∶5)為流動相B;梯度洗脫條件:0～40 min，A:85%→57%;40～55 min，A:57%→0%;55 ～56 min，A:0%→85%;檢測波長:248 nm;流速:1.0 mL/min;進樣濃度:200 μg/mL;進樣量:20 μL。

替加環(huán)素與中間體9-氨基米諾環(huán)素、米諾環(huán)素均在248 nm的波長處有強吸收，故選擇248 nm為本品有關物質檢查的檢測波長。

2.2 溶劑的配制 盡管本品易溶于水，但其在水溶液中的穩(wěn)定性較差?？紤]本品的理化性質，并參照相關文獻，制備含有還原劑的溶液作為稀釋液。具體制備方法:取4.35 g磷酸氫二鉀和0.5 g亞硫酸氫鈉于1 000 mL量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，用1 mol/L氫氧化鉀溶液調節(jié)pH值至8.0，作為稀釋溶劑。

2.3 溶液的制備 供試品溶液的制備:取本品適量(約相當于替加環(huán)素25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。對照溶液的制備:精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。系統(tǒng)適用性溶液的制備:精密稱取9-氨基米諾環(huán)素、鹽酸米諾環(huán)素各約12.5 mg，分別置100 mL量瓶中，用溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密稱取替加環(huán)素對照品約50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加上述溶劑50 mL使溶解，加三氟醋酸2滴，搖勻，置60～70℃的水浴中加熱約5 min，放冷;精密加入9-氨基米諾環(huán)素、米諾環(huán)素儲備液各1 mL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 在選定的色譜條件下，取系統(tǒng)適用性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，9-氨基米諾環(huán)素、替加環(huán)素差向異構體、替加環(huán)素、米諾環(huán)素的保留時間分別為14.4、16.0、21.3、34.7 min，各色譜峰之間的分離度均大于2.0。替加環(huán)素主峰理論板數70 710。色譜圖見圖1。

圖1 混合溶液的HPLC色譜圖

2.5 專屬性試驗 貯備液的配制:照“2.3”項下的方法制備供試品溶液，作為貯備液。

酸破壞試驗:量取貯備液9 mL，置具塞比色管中，加1 mol/L HCl溶液1 mL，搖勻，置室溫下放置8 h，用1 mol/L NaOH溶液中和，濾過，取續(xù)濾液作為酸破壞溶液。

堿破壞試驗:量取貯備液9 mL，置塑料瓶中，加1 mol/L NaOH溶液1 mL，室溫下放置20 h。用1 mol/L HCl溶液中和，濾過，取續(xù)濾液作為堿破壞溶液。

氧化破壞試驗:量取貯備液9 mL，置塑料瓶中，加30%雙氧水溶液1 mL，搖勻，放置10 min，濾過，取續(xù)濾液作為氧化破壞溶液。

高溫破壞試驗:量取貯備液9 mL，置具塞比色管中，置95℃水浴中加熱1 h，放冷至室溫，濾過，取續(xù)濾液作為高溫破壞溶液。

測定:精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。由試驗結果可見，本品在酸、堿、氧化、高溫環(huán)境中較不穩(wěn)定，有較多的降解雜質產生。在該色譜條件下，各試驗條件下破壞的降解產物均能與本品主峰獲得基線分離，表明該色譜系統(tǒng)的專屬性較好，能有效檢測本品的降解雜質。色譜圖見圖2。

2.6 供試品溶液的穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，分別置室溫條件及低溫(0～4℃)條件下放置，于0、2、4、6、8 h 時，分別精密量取 20 μL 進樣測定。結果表明，供試品溶液在室溫下放置，RRT為0.5的雜質增加明顯;低溫條件放置8 h，各雜質均無明顯變化。故實驗過程中供試品溶液應臨時新配，并避光、低溫放置。

2.7 進樣精密度試驗 精密量取對照溶液20 μL進樣測定，連續(xù)平行分析6次，記錄色譜圖，量取主峰面積，RSD為0.7%。

2.8 檢測限 精密量取貯備液適量，用溶劑逐級稀釋成一系列濃度的稀溶液，分別精密量取各溶液20 μL進樣測定，記錄色譜圖。當進樣濃度為0.18 μg/mL時，主峰的S/N≈3，即最低檢測限為0.18 μg/mL × 20 μL=3.6 ng。

2.9 樣品中的有關物質檢查 各批樣品均按“2.3”項下的方法制備供試品溶液與對照溶液。精密量取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20%。再精密量取供試液和對照液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質峰，溶劑峰忽略不計，量取各單個雜質峰面積，與對照液主峰面積比較。9-氨基米諾環(huán)素的峰面積不得大于主峰面積的0.7倍(0.7%)，替加環(huán)素差向異構體的峰面積不得大于對照液主峰面積的3倍(3.0%)，米諾環(huán)素的峰面積不得大于對照液主峰面積的1/2(0.5%)，其他單個雜質，峰面積不得大于對照液主峰面積的1/5(0.2%)，除差向異構體外的其他雜質，峰面積之和不得大于對照液主峰面積的3倍(3.0%)。三批供試品的測定結果見表1。

圖2 不同破壞試驗下注射用替加環(huán)素的HPLC色譜圖注:A.酸破壞試驗，B.堿破壞試驗，C.氧化破壞試驗，D.高溫破壞試驗;1.替加環(huán)素

表1 三批供試品的測定結果(%)

3 討論

3.1 本品為氨基堿性化合物，文獻報道［3］，替加環(huán)素的初始反應物米諾環(huán)素與主要合成中間體9-硝基米諾環(huán)素、9-氨基米諾環(huán)素的HPLC檢測方法均采用磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，加入少量乙二胺四乙酸二鈉或三乙胺，用磷酸調節(jié)pH值為6.0～6.4)-乙腈為流動相，通過調整緩沖鹽溶液的pH值及緩沖鹽溶液-乙腈的比例，能較好地控制以上化合物的純度。一般情況下，流動相中緩沖鹽溶液的最佳濃度范圍為0.01～0.1 mol/L。磷酸鹽緩沖液濃度增大，各峰保留時間延長，考慮達到分離要求的情況下，盡量選擇低濃度緩沖鹽溶液，選擇0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液。由于本品為含氮堿性藥物，極性較大，易被色譜柱上活性硅醇基強吸附，造成色譜峰拖尾。此外，硅膠中的微量金屬可以導致硅羥基的酸性增強，進而導致主峰拖尾;替加環(huán)素也易于與硅膠中微量的金屬離子螯合而不易洗脫，為了消除金屬離子的影響，從而使方法具有更好的耐用性，在流動相中加入了少量的金屬螯合劑-0.002mol/L的EDTA二鈉。

3.2 實驗中分別考察了 pH 7.0、pH 6.4和 pH 5.0的磷酸二氫鉀溶液-乙腈為流動相。結果顯示，隨著流動相中緩沖液pH值的提高，替加環(huán)素峰的保留時間增加，主峰與相鄰雜質峰的分離度增加。當緩沖液pH值為6.4時，主峰與各主要雜質均達到良好分離，且保留時間適中。分別調節(jié)流動相緩沖溶液的pH值為6.3、6.5、6.6，從而考察鹽溶液pH值對分離的影響，結果表明，緩沖溶液的pH值對各組分的保留時間及相互分離影響較大，故實驗過程中要嚴格控制緩沖溶液的pH值。

［1］ 王明華，王明貴.新型甘氨酰環(huán)素類抗生素-替加環(huán)素［J］.中國感染與化療雜志，2006，6(5):350-355.

［2］ 周澎濤，劉蕾.新型靜脈用甘氨酰環(huán)素類抗菌藥替加環(huán)素［J］.中國新藥雜志，2007，16(4):328-332.

［3］ Lalitha K，Sum PE，Sylvain D，et al.Tigecycline and methods of preparing 9-nitrominocycline［P］.WO，2006/130501.