高效液相色譜法測定佛手配方顆粒中橙皮苷的含量

吳懷恩，辛 華，盧澄生，劉圓圓，甄漢深，黃 莉

(1.廣西中醫(yī)學院，廣西 南寧 530001;2.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137)

佛手為蕓香科植物佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)的干燥果實，又稱佛手柑。性溫，味辛、苦、酸，歸肝、脾、肺經(jīng)。具有疏肝理氣、和胃止痛的功效，用于肝胃氣滯，胸肋脹痛，胃脘痞滿，食少嘔吐等癥[1]。佛手配方顆粒是佛手飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單味中藥配方顆粒劑。據(jù)報道[2-4]，橙皮苷是佛手飲片的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎、維持血管正常滲透壓、增強毛細血管韌性、降血脂和抗腫瘤等多種活性。2005年版《中國藥典》僅規(guī)定佛手藥材的顯微鑒別和薄層色譜鑒別，并未見含量測定。本文以高效液相色譜法(HPLC)測定制劑中橙皮苷的含量，為制定其質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);LG16-W型高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);B3500S-MT超聲清洗儀(上海必能信超聲有限公司);BP211D電子分析天平(德國賽多利斯)。

1.2 試藥

橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0721-9909);佛手配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號:0901041、0903054、0905115);甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇-0.1% 磷酸溶液(35∶65)，流速:1.0 mL/min，檢測波長:284 nm，柱溫:40 ℃，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品5.60 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得對照品貯備液(0℃保存)。精密吸取5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，使成每1 mL含橙皮苷56 μg的甲醇溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取佛手配方顆粒約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲提取60 min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 佛手配方顆粒中所用輔料為交聯(lián)淀粉。取交聯(lián)淀粉適量，按2.2.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 陰性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。陰性對照溶液在橙皮苷峰位置無色譜峰。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取橙皮苷對照品貯備液適量，稀釋成11.2，22.4，44.8，56.0，89.6 μg/mL 的溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為:Y=20469.6 X －6.5，r=0.9999。結(jié)果表明，橙皮苷在11.2～89.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密吸取2.2.1 項下對照品溶液 10 μL，連續(xù)進樣6次，計算峰面積RSD為0.87%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品(批號0901041)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，以2.1項下色譜條件分別在 0，2，4，6，8，12 h 進樣10 μL，測定橙皮苷峰面積，RSD為1.53%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性實驗

取同一批(批號0901041)供試品6份，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，以2.1項下色譜條件進樣10 μL，結(jié)果橙皮苷平均含量為0.2306 mg/g，RSD為2.18%。表明本法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

取同一批(批號0901041)已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的橙皮苷對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，以2.1項下色譜條件進樣10 μL，測定橙皮苷的含量，并計算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為 98.92%，RSD(n=6)為2.03%。

圖1 對照品(A)、供試品(B)和陰性對照(C)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard sample(A)，sample(B)and blank sample(C)

表1 加樣回收率測定結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品含量測定

取本品3批，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中橙皮苷含量測定結(jié)果Tab.2 Results of determination of Hesperidin in Foshou Dispensing Granules

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

預試驗中采用正交實驗L9(34)進行佛手配方顆粒的甲醇超聲提取工藝研究，以橙皮苷的含量為評價指標，選擇甲醇濃度(50%，75%，100%)、料液比(5∶1，10∶1，15∶1)、超聲時間(20，40，60 min)3 個因素。結(jié)果表明因素主次為:甲醇濃度＞超聲時間＞液料比，又由方差分析得到最佳提取工藝為100%甲醇，料液比5∶1，超聲提取60 min。

3.2 柱溫的選擇

實驗中發(fā)現(xiàn)柱溫對橙皮苷的tR值影響較大，40℃時可保證與樣品中其它組分有較好分離效果。

3.3 流動相的選擇

筆者曾比較甲醇-水(25∶75)[1]、甲醇-1.5% 磷酸(50 ∶50)[2]、甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)[5]、乙腈-1.5%磷酸(15∶85)[6]、甲醇-1.5% 磷酸(35∶65)等流動相，結(jié)果以甲醇-1.5%磷酸(35∶65)分離效果最好。實驗結(jié)果表明隨磷酸濃度的增加，峰形進一步變尖銳，但是考慮到酸度對色譜柱的影響，pH值不宜過低，故最終選用甲醇-0.1%磷酸(35∶65)為流動相。

[1]中國藥典[S].一部.2005:124.

[2]宋劍鋒，富同義.RP-HPLC法測定佛手飲片中橙皮苷含量[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25(5):1036-1037.

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[6]肖培根.新編中藥志[M].第二卷.北京:化學工業(yè)出版社，2003:352.