SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法

胡曉倩，陳來同，趙 健

(北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871)

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法

胡曉倩，陳來同，趙 健

(北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871)

目的 建立一種操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、無毒的蛋白質(zhì)電泳染色方法。方法 利用考馬斯亮藍(lán)G-250(CBB G-250)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色，對(duì)不同染色條件進(jìn)行探討，并與考馬斯亮藍(lán)R-250(CBB R-250)染色法進(jìn)行比較。結(jié)果 CBB G-250染色法試劑無毒，背景淺，經(jīng)改良其靈敏度與CBB R-250染色法相當(dāng)，達(dá)到0.1～0.5μg。結(jié)論 CBB G-250染色方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，靈敏度能夠滿足一般要求，適用于蛋白質(zhì)電泳結(jié)果的快速分析。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;染色方法;考馬斯亮藍(lán)G-250;靈敏度

蛋白質(zhì)條帶染色是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中的重要步驟，染色方法有多種［1］，考馬斯亮藍(lán)R-250(CBB R-250)(三苯基甲烷)染色法是生化實(shí)驗(yàn)室中蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)和定量分析常用的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250(CBB G-250)分子結(jié)構(gòu)略有不同，是一種甲基取代的三苯基甲烷，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)溶液濃度測(cè)定［2］，因其電泳染色靈敏度稍差，應(yīng)用較少。研究表明，酸性條件下CBB G-250分子的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水相互作用形成聚集體［3］，在電泳染色中染料是以聚集體的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合，高濃度的硫酸銨可以使染料分子的聚集體增加，提高染色靈敏度并降低背景［4-5］，用中性鹽作為脫色液可以快速無毒地達(dá)到很好的效果［6］。本文以 Bradford CBB G-250的染色液［2］為基礎(chǔ)，對(duì)SDS-PAGE凝膠的染色條件進(jìn)行探討和改良，力求建立一種更簡(jiǎn)便快速、靈敏的蛋白質(zhì)條帶染色方法。

1 材料

大腸桿菌DH5α菌株提取液來自本院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;blue plus protein marker(包含6種已知相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，Mr16 000～94 000)，北京全式金生物技術(shù)有限公司;CBB G-250，Amresco公司;牛血清白蛋白(BSA)(進(jìn)口分裝)，北京中北林格科技發(fā)展有限公司。

SE250小型垂直板電泳槽及電源，瑞典GE公司;HEλIOSα紫外-可見分光光度計(jì)，英國(guó)UNICAM公司;凝膠成像儀，法國(guó)Vilber Lourmat公司;脫色搖床，美國(guó)Parmer公司。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 CBB G-250 染色液 CBB G-250 100 mg，無水乙醇50 mL，85%磷酸100 mL，用去離子水稀釋至1 000 mL，濾紙過濾備用。

2.1.2 固定液 含50%甲醇或50%乙醇，10%乙酸，40%去離子水。

2.1.3 脫色液 7%乙酸溶液或0.25 mol/L氯化鉀溶液。

2.2 SDS-PAGE

電泳方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［7］，采用5%濃縮膠，12%分離膠(凝膠厚度1 mm)進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳完畢取出凝膠，置于不同成份的固定液中固定0.5～1 h;然后將凝膠置于不同成份的染色液中，振蕩染色1～3 h或過夜;棄去染色液，將凝膠置于不同成份的脫色液中脫色;對(duì)凝膠進(jìn)行照相。

2.3 根據(jù)CBB G-250顯色反應(yīng)的機(jī)理探討SDS對(duì)染色的影響

對(duì)CBB G-250染色液(含 15μg/mL BSA，2μg/mL SDS或含15μg/mL BSA和2μg/mL SDS)在320～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察SDS對(duì)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 固定液的成份及固定時(shí)間對(duì)染色效果的影響

電泳過程按照常規(guī)操作，固定液中含50%甲醇或50%乙醇，其它成分相同，固定時(shí)間0.5或1 h做比較。染色結(jié)果顯示，固定步驟是必需的，含50%甲醇固定0.5 h即可進(jìn)行染色，但固定1 h染色效果更佳;含50%乙醇固定時(shí)間0.5 h染色效果稍差，固定1 h以上可達(dá)到同樣效果;固定過程中更換固定液可以加強(qiáng)固定效果(圖1)?？梢娨掖纪耆梢蕴娲状甲鳛楣潭ㄒ旱挠行С煞郑档凸潭ㄒ旱亩拘?。

3.2 CBB G-250染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響

電泳和固定過程按照常規(guī)操作，用CBB G-250染色液染色1，2，3 h或過夜，結(jié)果表明染色1 h已能初步觀察結(jié)果，染色3 h蛋白質(zhì)條帶顏色已到達(dá)飽和，與染色過夜的結(jié)果相當(dāng)(圖2)。所以染色2 h能夠基本滿足要求，對(duì)于濃度較低的樣品可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。

3.3 CBB G-250染色液中磷酸的含量對(duì)染色效果的影響

對(duì)染色液中含85%磷酸分別為10%，15%，20%時(shí)進(jìn)行染色試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)染色液中含10%的85%磷酸時(shí)染色效果最好。反應(yīng)體系的酸度影響染料分子的質(zhì)子化程度，從掃描光譜看到吸收峰的高度和位置均發(fā)生變化［3］。當(dāng)染色液中含有10%的85%磷酸時(shí)，染料分子的磺酸基仍然多處于解離狀態(tài)，利于與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸殘基結(jié)合。當(dāng)染色液中含有15%以上的85%磷酸時(shí)，染料分子的聚集程度增加使得部分染料分子沉淀出來，造成染色效果較差。

圖1 固定液的成份及固定時(shí)間對(duì)染色效果的影響Fig.1 The effect of fixative composition and fixed time on the staining

圖2 CBB G-250染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響Fig.2 The effect of fixed time of CBB G-250 on the staining

3.4 CBB R-250與CBB G-250染色靈敏度的比較

用不同濃度的BSA溶液作為樣品進(jìn)行電泳，利用CBB R-250和CBB G-250兩種染色液分別染色，CBB R-250的染色靈敏度達(dá)到0.1μg，CBB G-250的染色靈敏度僅1μg。在CBB G-250染色液中加入10%硫酸銨，可使其染色靈敏度提高到0.1～0.5μg(圖3)，基本能達(dá)到CBB R-250的染色水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度的硫酸銨能促進(jìn)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，在提高染色靈敏度的同時(shí)沒有加深背景。

3.5 脫色液的改良

CBB G-250染色后背景很淺，對(duì)于濃度高的樣品可以直接觀察到條帶，利用7%乙酸漂洗2h即可脫去背景的顏色。試用0.25 mol/L氯化鉀溶液進(jìn)行脫色比乙酸脫色效果更明顯，條帶更清晰，且無毒無味，利于環(huán)保。

圖3 硫酸銨對(duì)CBB G-250染色靈敏度的影響Fig.3 The effect of(NH4)2SO4 on the sensitivity of CBB G-250

3.6 SDS對(duì)CBB G-250染色的影響

對(duì)CBB G-250染色液及含有BSA和SDS的染色液在320～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，從掃描圖譜(圖4)觀察到，CBB G-250染色液在465和645 nm有吸收峰，當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在595 nm處出現(xiàn)了一個(gè)峰與645 nm的峰疊加;當(dāng)染色液中含有SDS時(shí)，染料分子及其與蛋白質(zhì)結(jié)合后的掃描曲線均發(fā)生了變化，第2個(gè)峰移到660 nm，且595 nm處的吸收變得不明顯。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)SDS的存在確實(shí)影響染色效果，其原因可能是由于SDS易于與蛋白質(zhì)結(jié)合，它的存在干擾染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而影響染色效果。實(shí)驗(yàn)表明在固定步驟中更換固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過采用 CBB G-250染色法，乙醇完全可以替代甲醇作為固定液的有效成分，這樣可以降低固定液的毒性，使操作更加安全;染色液中含10%的85%磷酸時(shí)染色效果最好，在染色液中加入10%硫酸銨，可使其染色靈敏度明顯提高，染色2 h能夠達(dá)到最佳效果，對(duì)于濃度較低的樣品可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間;用0.25 mol/L氯化鉀溶液替代7%乙酸溶液漂洗脫色效果更明顯，條帶更清晰，且無毒無味，有利于環(huán)保;此外固定步驟很重要，更換固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。雖然CBB G-250染色法靈敏度略遜于CBB R-250染色法，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)的改良基本能達(dá)到CBB R-250的染色水平。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于CBB G-250能快速結(jié)合蛋白質(zhì)，染色時(shí)間短，而背景顏色很淺，易于脫色，對(duì)于蛋白質(zhì)含量較大的樣品染色1 h不經(jīng)脫色即可觀察結(jié)果，并且重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，所以CBB G-250染色法是一種經(jīng)濟(jì)快捷實(shí)用的方法，適用于蛋白質(zhì)電泳定量分析，值得推廣使用。

圖4 SDS對(duì)CBB G-250染色的影響Fig.4 The effect of SDSon CBB G-250 staining

［1］郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2005:63-78.

［2］Bradford M M.A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［3］曹穩(wěn)根，焦慶才，劉 茜，等.考馬斯亮藍(lán)顯色劑變色反應(yīng)機(jī)理的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，60(9):1656-1661.

［4］Neuhoff V，Arold N，Taube D，et al.Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250［J］.Electrophoresis，1988，9:255-262.

［5］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver:A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis，2004，25:1327-1333.

［6］周國(guó)權(quán)，巫光宏，黃翠顏，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳的快速脫色方法［J］.植物生理學(xué)通訊，2006，42(1):95-97.

［7］J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.2 版.北京:科學(xué)出版社，1993:880-886.

Investigation of protein staining protocols of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

HU Xiao-qian，CHEN Lai-tong，ZHAO Jian
(School of Life Sciences，Peking University，Beijing 100871，China)

Purpose To establish a simple，rapid，highly sensitive，non-toxic protein electrophoresis staining protocol.Methods By utilizing Coomassie Brilliant Blue G-250(CBB G-250)to stain the protein bands by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)，the different dyeing conditions were explored and compared to the staining of Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB R-250).Results CBB G-250 staining protocol presents non-toxic，light background and comparable sensitivity after optimization to CBB R-250 staining，which is reaching 0.1-0.5 μg.Conclusion CBB G-250 staining protocol is simple and economic.Its sensitivity could meet the general requirements，and is applicable to the rapid analysis of protein electrophoresis.

SDS-PAGE;staining method;Coomassie Brilliant Blue G-250;sensitivity

Q503

A

1005-1678(2011)02-0128-03

2010-01-26

胡曉倩，女，工程師，主要從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究工作，Email:huxiaoqian@pku.edu.cn。