慢性間歇性低壓低氧對丹皮酚抑制大鼠回腸收縮活動的影響*

宋 爽 宋士軍 張 翼 于 雷 趙晗潔 吳 嬋

慢性間歇性低壓低氧（chronic intermittent hypo?baric hypoxia，CIHH）是指一定時間間斷地暴露于低壓低氧環(huán)境,而其余時間處于常壓常氧環(huán)境。研究表明，CIHH可對抗缺血/再灌注引起的心肌損傷，并具有抗心律失常作用[1]。也有報道CIHH可以改變受體的反應(yīng)性[2]，CIHH有望作為一種治療手段用于臨床。丹皮酚（牡丹酚，paeonol，Pae）是中藥牡丹皮和徐長卿中的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗腦梗死、抗糖尿病和抗腫瘤等多種藥理作用。常用于治療口腔潰瘍、胃病、肝炎、胰腺炎、腸炎、急性闌尾炎等消化系統(tǒng)疾病[3]。CIHH和丹皮酚對消化道平滑肌收縮活動的影響均少見報道。本研究旨在觀察CIHH處理前后，丹皮酚對大鼠回腸平滑肌的作用及作用機制的異同點，為臨床上應(yīng)用CIHH和丹皮酚提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器 丹皮酚購自Alfa Aesar公司，使用時用75%乙醇溶解；心得安（propranolol）、阿托品（Atropine）、左旋硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME）、格列苯脲（glibenclamide，Gli）和乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）均購自Sigma公司；吲哚美辛（Indomethacin，Indo）購自Calbiochem公司。其余藥物均為國產(chǎn)分析純。Krebs液（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7,CaCl22.5，MgSO41.2，NaHCO325.0，KH2PO41.2,葡萄糖 11.0，pH 7.4。無鈣Krebs液不加Ca?Cl2。SQG-4四腔器官浴槽系統(tǒng)（成都儀器廠生產(chǎn)），HSS-1型恒溫浴槽（成都儀器廠生產(chǎn)），BL-420E+生物功能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawlay(SD)大鼠48只，清潔級，250~300 g，雌雄兼有，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：1001002，許可證號：CXK（冀）2008-1-003。

1.3 大鼠離體回腸標本制備 大鼠實驗前24 h禁食，自由飲水，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，迅速開腹,從回盲部取出末端回腸6~7 cm，用Krebs液沖洗內(nèi)容物，然后將其剪成約1 cm的腸段備用。將腸段置于平滑肌槽內(nèi)用Krebs液浸浴，溫度調(diào)節(jié)為（37.0±0.5）℃恒溫,持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體；腸段通過張力換能器與BL-420E+生物功能實驗系統(tǒng)連接并記錄收縮活動，加前負荷1.0 g，平衡1 h，每20 min換液1次，待腸段自主收縮活動穩(wěn)定后開始加藥。

1.4 實驗分組 48只大鼠隨機分為CIHH組和正常氧（CON）組，每組24只，每只大鼠可取得回腸段5~6段，每組動物中的每個腸段均來自不同的大鼠；CIHH組置于低壓氧艙接受28 d模擬5 000 m海拔高度的低壓低氧處理，每日6 h，自由食水，每周監(jiān)測體質(zhì)量變化。CON組除不接受慢性低壓低氧處理之外，其余與CIHH組動物相同。

1.4.1 CIHH對丹皮酚抑制大鼠回腸平滑肌收縮活動的影響 在CON和CIHH組中隨機抽取不同大鼠的1個腸段，8個腸段為一小組，CON和CIHH組各分為丹皮酚組和對照組，丹皮酚組以5 min為間隔加入丹皮酚，使灌流槽Krebs液中丹皮酚累計濃度分別為20、40、80、160、320和640 mg/L。對照組加入與丹皮酚等體積的75%乙醇。記錄各時間點收縮活動的幅度、頻率和張力，并計算活動力（活動力=幅度×頻率）[4]。將各指標換算成占給藥前相對應(yīng)指標的百分數(shù)。以活動力為指標，用Logit法[5]計算CON和CIHH組的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.2 回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動的測定 分組方法同1.4.1丹皮酚組加入150 mg/L丹皮酚，對照組加入等體積乙醇。對ACh引起的細胞內(nèi)Ca2+和外Ca2+性收縮的影響參照文獻[6]的方法進行測定。參照文獻[7]的方法分別測定庫容性鈣通道開放引起的收縮（SOCE誘發(fā)的收縮）和高K+誘發(fā)的電壓門控鈣通道開放引起的收縮。

1.4.3 各種藥物對丹皮酚作用的影響 在CON和CIHH組中隨機抽取不同大鼠的1個腸段，8個腸段為一小組，CON和CIHH組各分為對照組、心得安組、L-NAME組、格列苯脲組和吲哚美辛組，待腸段收縮活動穩(wěn)定后，各組分別加入蒸餾水、心得安10 μmol/L、L-NAME 0.3 mmol/L、格列苯脲5 μmol/L和吲哚美辛10 μmol/L，10 min后加入丹皮酚150 mg/L，記錄收縮幅度并計算占給藥前收縮幅度的百分數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)分析均由SPSS 13.0完成。用均數(shù)±標準差（x ±s）的形式表示，兩組間均值比較應(yīng)用t檢驗，多組間均值比較應(yīng)用單因素方差分析和Dunnett-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CIHH對丹皮酚抑制大鼠回腸平滑肌收縮活動的影響 丹皮酚從幅度、頻率、張力和活動力方面均顯著抑制CON和CIHH大鼠回腸平滑肌的收縮活動。與對照組相比丹皮酚多個劑量在幅度、頻率、張力和活動力方面的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1、2。以活動力為指標計算IC50分別為65.13 mg/L和135.74 mg/L。CIHH明顯減弱了丹皮酚對大鼠離體回腸的抑制作用，與CON相比，當?shù)てし觿┝繛?0~640 mg/L時，在幅度和活動力方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表3。

2.2 丹皮酚對大鼠回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動的影響 在CON，丹皮酚顯著抑制了ACh引起的細胞內(nèi)外Ca2+性收縮、SOCE誘發(fā)的收縮和高K+誘發(fā)的收縮，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在CIHH，丹皮酚顯著抑制了ACh引起的細胞外Ca2+性收縮和高K+誘發(fā)的的收縮，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而對細胞內(nèi)鈣性收縮和SOCE誘發(fā)的收縮無顯著影響（P>0.05），見表4。

2.3 各種藥物對丹皮酚作用的結(jié)果 在CON，心得安組、L-NAME組和吲哚美辛組可部分阻斷丹皮酚對回腸平滑肌收縮幅度的抑制作用，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表5，而格列苯脲組對丹皮酚的作用無影響（P>0.05）。在CIHH，L-NAME組和吲哚美辛組可部分阻斷丹皮酚對回腸平滑肌收縮幅度的抑制作用，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而心得安組和格列苯脲組對丹皮酚的作用無顯著影響（P>0.05），見表5。

表1 丹皮酚對CON大鼠回腸自發(fā)收縮活動的影響 （n=8，%，x ±s）

表2 丹皮酚對CIHH大鼠回腸自發(fā)收縮活動的影響 （n=8，%，x ±s）

表3 丹皮酚對CIHH大鼠回腸平滑肌收縮活動影響的統(tǒng)計量 （t）

表4 丹皮酚對大鼠回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動的影響 （n=8，x ±s，%）

3 討論

本研究結(jié)果表明，丹皮酚從幅度、頻率、張力和活動力4個方面抑制了大鼠離體回腸的收縮活動，CIHH預(yù)處理后顯著減弱了丹皮酚對大鼠離體回腸的抑制作用。

表5 各種藥物對丹皮酚作用后回腸平滑肌收縮幅度的影響 （n=8，x ±s，%）

消化道平滑肌細胞膜上存在著電壓操縱性鈣通道（voltage-operated Ca2+channel，VOCC）[7]，高鉀可使膜電位去極化，誘導(dǎo)VOCC開放而引起平滑肌收縮。丹皮酚抑制了正常氧和CIHH大鼠高鉀誘導(dǎo)的回腸平滑肌收縮，提示丹皮酚抑制回腸收縮的機制之一是抑制了VOCC的開放。

鈣庫操縱性鈣通道（store-operated Ca2+channel，SOCC）屬于受體操縱性鈣通道的一種，SOCC主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+量調(diào)控，在內(nèi)鈣耗竭情況下打開SOCC，進而導(dǎo)致平滑肌收縮[7]；丹皮酚在內(nèi)鈣耗竭、M受體被阻斷的情況可以抑制正常氧大鼠回腸的收縮活動，提示丹皮酚可能抑制了細胞SOCC的開放而抑制回腸收縮；但是在CIHH大鼠無此作用，提示CIHH能夠取消丹皮酚的此作用。

NO可激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而提高細胞內(nèi)cGMP水平，降低Ca2+濃度使平滑肌舒張，抑制胃腸運動,也可能通過非cGMP依賴途徑引起平滑肌舒張[8]，L-NAME是NOS的抑制劑，本實驗中L-NAME可部分阻斷丹皮酚對正常氧和CIHH大鼠回腸收縮活動的抑制作用，提示丹皮酚可能通過刺激NOS的活性而增加細胞內(nèi)NO的含量進而抑制回腸收縮。

激動β2受體可使回腸平滑肌細胞舒張[9]，心得安是β受體的阻斷劑。本實驗中心得安部分阻斷了丹皮酚對正常氧大鼠回腸平滑肌收縮活動的抑制作用，提示丹皮酚激動了平滑肌的β2受體而抑制回腸收縮；但是CIHH抑制了心得安對丹皮酚的部分阻斷作用，說明CIHH可以通過降低β受體反應(yīng)性，來對抗丹皮酚的此項作用，這與以往的報道相符[2]。

前列腺素（prostaglandin，PG）族的前體花生四烯酸在環(huán)氧合酶（COX）等的作用下可以形成PGE2和PGD2等物質(zhì)，PGE2可以通過作用于EP1受體使腸肌收縮，而PGD2可以通過作用于DP受體使腸肌舒張[10]。吲哚美辛是環(huán)氧合酶的非特異性抑制劑。本實驗中吲哚美辛可部分阻斷丹皮酚對CON和CIHH大鼠回腸平滑肌的抑制作用，提示丹皮酚可能改變了COX的活性而促進了具有舒張作用的PG的合成或釋放進而抑制回腸收縮。

CIHH預(yù)處理減弱了丹皮酚對大鼠離體回腸的抑制作用，其機制可能是CIHH通過使受體和離子通道敏感性下降實現(xiàn)的；本研究也發(fā)現(xiàn)CIHH處理后取消了丹皮酚的抑制內(nèi)鈣釋放、抑制庫容性鈣內(nèi)流和激動β2受體作用；至于CIHH處理后為什么改變了離子通道和受體對丹皮酚的反應(yīng)性及臨床意義有待進一步探討。

[1]張翼，楊黃恬，周兆年.間歇性低氧適應(yīng)的心臟保護[J].生理學(xué)報,2007,59(5):601-613.

[2]王瑩萍，布會敏，王妹玲，等.慢性間歇性低壓低氧對家兔竇房結(jié)腎上腺素能受體反應(yīng)性的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(3)：435-439.

[3]楊正生，彭振輝，姚青海，等.丹皮酚的藥理作用研究進展[J].中國藥物與臨床，2011，11(5)：545-547.

[4]謝燕，玄振玉，于莉，等.舒經(jīng)克痛軟膠囊對大鼠子宮活動的影響[J].中國中藥雜志，2008，33(12)：1466-1469.

[5]劉昌孝，孫瑞元.藥物評價實驗設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1999：31-32.

[6]宋士軍,李芳芳,徐瑛,等.金銀花和黃芩對家兔小腸平滑肌收縮和電活動的影響[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2009,25(3)：344-348.

[7]柯道平,周華,李忠穩(wěn),等.庫容性Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)大鼠遠端結(jié)腸平滑肌收縮[J].中國藥理學(xué)通報,2006,22(3)：344-348.

[8]Rosa S,Maria GZ,Flavia M.Nitric oxide induces muscular relax?ation via cyclic GMP-dependent and-independent mechanisms in the longitudinal muscle of the mouse duodenum[J].Nitric Oxide,2003,8(1)：48-52.

[9]白波，高明燦.生理學(xué)[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010：227-228.

[10]徐紅,孫宏斌.前列腺素受體及相關(guān)藥物的研究進展[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2010,41(5)：385-394.