HPMA在骨靶向藥物輸送方面的應(yīng)用

劉衍志，崔 燎

(1.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

1 簡介

HPMA(N－2－羥丙基-甲基丙烯酰胺聚合物)是1975年由Kopecek實(shí)驗(yàn)室研究合成出來的多聚物。起初HPMA被設(shè)計(jì)成血漿增容劑，幾十年后此種水溶性多聚物的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，從工業(yè)應(yīng)用到大分子藥物，逐漸在高分子治療領(lǐng)域中扮演重要的角色。HPMA最先應(yīng)用于作為抗癌藥物的載體，取得了顯著的成效，現(xiàn)在至少有5種相關(guān)藥物處在不同的臨床試驗(yàn)階段［1］。隨著對HPMA藥物輸送系統(tǒng)研究的不斷深入，HPMA用于藥物載體的研究逐漸拓展到骨骼疾病與炎癥疾病等領(lǐng)域。

HPMA的創(chuàng)造者Kopecek說，經(jīng)過詳細(xì)研究一系列親水性聚合物的結(jié)構(gòu)和它們的生物相容性的關(guān)系后，選擇了N取代的甲基丙烯酰胺做為他們的目標(biāo)，因?yàn)樵讦粒既〈蚇－取代的酰胺鍵能夠保證聚合物側(cè)鏈的水解穩(wěn)定性［2］。把HPMA作為藥物載體的特點(diǎn)如下:

1.1 合成方法簡單 HPMA可以通過共聚作用，同型聚合反應(yīng)［3］，以及多種單體聚合而合成。聚合物的分子量和多分散性可以通過游離自由基聚合反應(yīng)控制，比如說ATRP或者是 RAFT 技術(shù)［4，5］

1.2 合成出的多聚物具有良好的水溶性和生物相容性 改進(jìn)疏水性小分子藥物的水溶性，使藥物分子的生物利用度增高，保護(hù)不穩(wěn)定分子使其不容易降解，增加藥物分子在血漿內(nèi)的循環(huán)時間，降低藥物的非特異性毒性以及增加藥物在目標(biāo)位點(diǎn)的累積［6］。

1.3 聚合物側(cè)鏈可通過多種反應(yīng)添加多種治療分子，靶向分子，以及示蹤分子。HPMA與藥物連接結(jié)構(gòu)是藥物靶向到預(yù)定部位釋放的重要的組成部分，根據(jù)對藥物機(jī)理的研究加上對特定組織或器官具體微環(huán)境特點(diǎn)的研究，用不同的連接結(jié)構(gòu)接上各種功能性因子［7～9］。

1.4 從機(jī)理上看，對HPMA復(fù)合藥物輸送系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)可以改變藥物的內(nèi)化，細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸路徑，增強(qiáng)藥物的作用和靶向性［10］。

2 HPMA應(yīng)用于骨靶向輸送系統(tǒng)的研究

目前大部分治療骨骼疾病的藥物都沒有針對骨骼的特異性，而且集中于抗骨吸收藥物，在一些促骨形成藥物的研究中，雖然一些藥物有很好的促骨形成效果，但是常常也伴隨著較強(qiáng)的副作用，限制了此類藥物的臨床應(yīng)用。例如前列腺素1和2以及它們的類似物、PTH等。因此學(xué)者們致力于研究靶向骨骼的藥物。骨骼是一種特殊的器官，它與其他軟組織和器官的區(qū)別在于含有大量的羥基磷灰石。基于此特點(diǎn)，研究者們致力于尋找與羥基磷灰石具有強(qiáng)烈親和力的分子，目前主要有四環(huán)素(TC)，鈣黃綠素，雙磷酸鹽(BPs)，D構(gòu)型天冬氨酸寡肽(D－Aspx)等。

2.1 HPMA－TC 首先被選為與HPMA相結(jié)合的靶向分子是四環(huán)素。四環(huán)素是一種常見的抗生素，其對骨內(nèi)羥基磷灰石(HA)有著強(qiáng)烈的親和力，因此極容易沉積于骨骼和牙齒中，在骨骼和牙齒的新生階段尤為常見。在骨形態(tài)計(jì)量領(lǐng)域常被用來作為骨骼形成的標(biāo)記物。前期的研究者利用結(jié)構(gòu)簡單的TC結(jié)構(gòu)類似物(ATC)合成HPMA－TC復(fù)合物［11］，在最初動物體內(nèi)試驗(yàn)表明，此復(fù)合物能很好的與體內(nèi)的羥基磷灰石相結(jié)合，但是復(fù)合物在單次的大劑量注射后，出現(xiàn)動物死亡。急性的低血鉀癥被懷疑是主要的原因。

2.2 HPMA－ALN 雙磷酸鹽類藥物能夠強(qiáng)力抑制骨的吸收，而且對骨骼內(nèi)的羥基磷灰石有非常好的親和力。單次注射阿侖膦酸鈉(ALN)，總藥量的50%都分布在骨骼上。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)ALN能強(qiáng)力附著在各種類型的骨表面，體外ALN對羥基磷灰石的附著實(shí)驗(yàn)證明［12］，其對羥基磷灰石結(jié)晶度成熟程度并不敏感，在各種類型的羥基磷灰石均可很好的附著。這些研究使得ALN作為骨靶向的前藥有很好的前景。

在合成HPMA－ALN聚合物的早期，合成的策略是先合成甲基丙烯酸ALN單體，然后再聚合成HPMA－ALN，但這樣的策略無法用常規(guī)方法從得到的甲基丙烯酸鹽衍生物中分離出合成產(chǎn)物甲基丙烯酸ALN單體。后來轉(zhuǎn)為利用同型聚合物反應(yīng)，仍然存在低反應(yīng)率，低ALN配合率的問題，產(chǎn)物的分離要求也比較高(需制備型HPLC)［13］。因此合成HPMA－ALN的路線尚需研究優(yōu)化。FITC標(biāo)記的HPMAALN在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)合物能夠有效的螯合到骨骼上，特別是螯合在骨高轉(zhuǎn)換位點(diǎn)［14］。

Satchi－Fainaro的實(shí)驗(yàn)室利用HPMA－ALN復(fù)合物的親骨特性，在HPMA上接入強(qiáng)力的血管生成抑制因子TNP－470用于靶向骨腫瘤的治療，取得了很好的效果［15］。通過可逆加成－斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)將HPMA、ALN以及TNP－470連接形成復(fù)合物HPMA－ALN－TNP－470。此復(fù)合物帶有一個組織蛋白酶K－清除連接基團(tuán)，當(dāng)復(fù)合物正確到達(dá)骨骼位點(diǎn)后，裂解釋放TNP－470。HPMA－ALN－TNP－470復(fù)合物能夠通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞的分化、遷移以及類毛細(xì)血管樣微管形成，減少腫瘤的高血管滲透性，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合物能顯著抑制人骨腫瘤生長達(dá)96%。

2.3 HPMA－Aspx 研究證實(shí)陰極氨基酸是一些骨相關(guān)蛋白的主要構(gòu)成成分，而發(fā)現(xiàn)唾液蛋白能夠強(qiáng)烈的與牙釉質(zhì)相結(jié)合的原因是由于唾液蛋白的一級結(jié)構(gòu)中存在有陰性氨基酸序列。因此，陰性氨基酸序列可被用于發(fā)展成為骨靶向藥物的靶向分子。在合成出雌二醇與天冬氨酸六肽(Asp6)的復(fù)合物(E2·3D6)實(shí)驗(yàn)中單次注射一天后，骨骼內(nèi)的雌二醇含量是單用雌二醇的100倍，在骨骼中聚集了有效濃度的雌二醇刺激骨形成，延緩骨丟失，而且E2·3D6的使用不會像單用E2那樣，出現(xiàn)肝臟肥大等副作用［16］。

天冬氨酸寡肽與HA的結(jié)合能力只與氨基酸的數(shù)目相關(guān)，研究者為了得到更好的骨靶向性，選擇了合成用FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的D構(gòu)型天冬氨酸八肽與HPMA復(fù)合物(HPMA－GG－D －Asp8－FITC)［7］。在體外的羥基磷灰石結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合物能迅速的與羥基磷灰石結(jié)合，1 h內(nèi)，80%的復(fù)合物都附著在羥基磷灰石上。健康小鼠靜脈注射劑量0.5 g·kg－1P－GG －D －Asp8－FITC，在24 h后取長骨切片計(jì)量學(xué)結(jié)果顯示，骨干的內(nèi)膜、外膜以及骨干骺端的骨表面均可見復(fù)合物附著，尤其在骨轉(zhuǎn)換高的區(qū)域，比如骨干骺端的松質(zhì)骨區(qū)域［14］。復(fù)合物在去卵巢三個月后的大鼠(OVX)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，依舊使用0.5 g·kg－1劑量的 HPMA －GG－D－Asp8－FITC注射，結(jié)果同樣顯示，復(fù)合物能夠很好的結(jié)合在骨轉(zhuǎn)換高的位點(diǎn)［17］。

HPMA－D－Asp8與HPMA－ALN骨形態(tài)計(jì)量學(xué)對比研究發(fā)現(xiàn)，雖然兩者都很好的結(jié)合在骨高轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，但是它們結(jié)合的區(qū)域并不完全相同，HPMA－ALN在骨轉(zhuǎn)換中的骨形成和骨吸收區(qū)域都有分布，而HPMA－D－Asp8更傾向于分布在骨吸收表面。在一項(xiàng)ALN與Asp8體外對羥基磷灰石結(jié)合度的對比實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩者的區(qū)別，首先ALN與牙釉質(zhì)的平均親和力有190 N，而Asp8的親和力只有100 N。其次ALN與Asp8分別與兩種結(jié)晶度不同的羥基磷灰石進(jìn)行粘合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果ALN與不同結(jié)晶度的羥基磷灰石粘合百分率相同，而Asp8粘合百分率顯著傾向于成熟的，結(jié)晶度高的羥基磷灰石(例如骨吸收表面)［12］。

至此，總結(jié)一下可以得出，TC，D－Asp8，ALN三種靶向分子的特性，TC青睞骨形成表面，D－Asp8青睞骨吸收表面，而ALN則可以等同分布于兩種表面。

這些研究結(jié)果使得研究者今后在研究骨靶向藥物的時候，能夠不僅僅是將藥物靶向到骨骼，而是可以通過選擇不同的靶向分子使藥物能夠更進(jìn)一步的靶向到骨的不同表面，從而發(fā)揮更為準(zhǔn)確的作用。

2.4 HPMA－PGE1PGE1是強(qiáng)力的促骨生成因子，當(dāng)給予促骨合成劑量范圍的藥物時，PGE1能夠激活相應(yīng)骨細(xì)胞表面上的的EP受體達(dá)到促骨合成的作用。它被選為第一個與HPMA聚合物靶向骨骼疏松系統(tǒng)相結(jié)合的治療因子，利用之前介紹過的對骨骼有很好靶向性的P－Asp8與PGE1相結(jié)合，形成一個靶向骨骼的藥物輸送系統(tǒng)(HPMA－D－Asp8－PGE1)。此復(fù)合物包含了雙靶向的設(shè)計(jì)(D－Asp8和組織蛋白酶K特異性裂解片段)。首先D－Asp8將藥物系統(tǒng)靶向骨骼，當(dāng)復(fù)合物粘附骨骼，由于破骨細(xì)胞特異性表達(dá)組織蛋白酶K，尤其傾向于粘附在骨吸收表面，特異性裂解片段裂解，釋放PGE1。這樣的輸送系統(tǒng)首先能大大減少PGE1的副反應(yīng);其次使PGE1能在最需要新骨形成的區(qū)域(骨吸收表面)刺激新骨形成，保持甚至改善骨質(zhì)量;再次P－Asp8－PGE1復(fù)合物能夠避免PGE1在到達(dá)釋放位點(diǎn)之前，各種可能的消除機(jī)制對PGE1的破壞，延長PGE1在體內(nèi)的半衰期，最后復(fù)合物輸送系統(tǒng)能在完成輸送任務(wù)后再從骨骼中裂解清除，通過腎小球?yàn)V過排出體外［2］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物進(jìn)行了體外細(xì)胞評價實(shí)驗(yàn)，復(fù)合物分別引入到破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，在它們的前體細(xì)胞以及非骨骼細(xì)胞中，觀察復(fù)合物對細(xì)胞的影響及其進(jìn)入細(xì)胞的途徑。共聚焦熒光顯微鏡的結(jié)果顯示，細(xì)胞均通過內(nèi)吞作用將復(fù)合物“吃”入細(xì)胞，并聚集于溶酶體/內(nèi)體區(qū)域，然后裂解釋放PGE1。在人源的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，PEG1的釋放順序?yàn)槠乒羌?xì)胞(FLG－OC)＞成骨細(xì)胞(Saos－2－OB)成骨前體細(xì)胞(Saos－2)，破骨前體細(xì)胞(FLG29.1)，以及控制組細(xì)胞(HS－5)。在鼠源的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中與人源的基本一致，但有細(xì)微差別。此實(shí)驗(yàn)證實(shí)HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物能順利的進(jìn)入破骨/成骨細(xì)胞內(nèi)，通過結(jié)構(gòu)中的組織蛋白酶K裂解片段的裂解釋放PEG1，間接證實(shí)了藥物輸送系統(tǒng)將在骨骼高轉(zhuǎn)換區(qū)域富集并發(fā)揮作用。另外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L和酯酶也是對PEG1的釋放發(fā)揮作用的酶［18］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物在老年去卵巢大鼠(OVX)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示［19］，單次注射28 d后，去卵巢大鼠的骨形成率(BFR)，礦化表面百分率(MS)等骨形成指標(biāo)與非靶向?qū)φ战M相比顯著提高，并且HPMA－D－Asp8－PGE1的注射沒有發(fā)現(xiàn)常常伴隨著單純PEGs注射出現(xiàn)的顯著的不良反應(yīng)。更為重要的是，PGE1與HPMA形成靶向藥物輸送系統(tǒng)后，復(fù)合物中含有的少量PEG1能夠達(dá)到以往使用大量PGE1才能達(dá)到的生骨效果。

雖然HPMA－D－Asp8－PGE1靶向輸送系統(tǒng)展示了很好的效果，但還面臨著一些問題。在人、大鼠、小鼠血漿，37℃溫育測定藥物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中。HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物在人血漿中表現(xiàn)穩(wěn)定，但在鼠類血漿中卻釋放了大量的PGE1，這可能是復(fù)合物結(jié)構(gòu)中PGE1與HPMA相連的酯鍵在血漿中裂解釋放了PGE1，在大鼠血漿中，酯鍵主要由丁酰膽堿酯酶催化裂解，而在小鼠血漿中，酯鍵的裂解不僅由丁酰膽堿酯酶催化，羧酸酯酶也參與了裂解［20］。這樣的種屬特異性使得HPMA－D－Asp8－PGE1靶向藥物的發(fā)展陷入了一種尷尬的境地，因?yàn)樗幬锏呐R床前評價必須在鼠類模型及其他非鼠類動物模型上評估，所以即使復(fù)合物在人血漿中表現(xiàn)穩(wěn)定，但此在鼠類循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的缺陷，使得HPMA－DAsp8－PGE1必須進(jìn)一步改良。值得慶幸的是，復(fù)合物在老年OVX大鼠上的實(shí)驗(yàn)，并沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的與設(shè)計(jì)目的不符的結(jié)果。

3 HPMA藥物靶向輸送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與展望

目前HPMA藥物輸送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)主要分為四部分，以HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物為例。①是HPMA;②是靶向分子;③是治療分子;④是連接靶向分子和藥物分子的連接基團(tuán) ，如圖1。

3.1 HPMA分子的設(shè)計(jì)

3.1.1 HPMA的分子量的大小是藥物輸送系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)半衰期，消除半衰期，以至輸送系統(tǒng)的被動靶向性的關(guān)鍵因素。分子量大的輸送系統(tǒng)能夠獲得更長的半衰期，但其在肝和脾的聚集也響應(yīng)增多［17］。

3.1.2 HPMA的構(gòu)型(如圖2)是藥物的合成，藥物的釋放率等方面的關(guān)鍵因素，好的構(gòu)型設(shè)計(jì)能夠提高藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸效率，提高藥效，同時在被動靶向性方面也將帶來益處(例如高通透性和滯留效應(yīng)，EPR)，但是復(fù)雜的構(gòu)型設(shè)計(jì)將給藥物合成階段帶來困難，而且構(gòu)型產(chǎn)生的空間位阻也會給藥物的釋放帶來影響。目前按HPMA的側(cè)鏈連接的位置不同主要分為:①直線型;②側(cè)鏈型;③雙鏈HPMA交聯(lián)型;(4)多條或者星形HPMA交聯(lián)型。每一種形態(tài)的空間結(jié)構(gòu)對于聚合物在體內(nèi)的清除率都有重要的影響，目前輸送系統(tǒng)設(shè)計(jì)主要的應(yīng)用在側(cè)鏈型HPMA。

圖1 HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

圖2 HPMA多聚物的結(jié)構(gòu)

3.2 藥物分子的連接基團(tuán)設(shè)計(jì) 連接基團(tuán)的設(shè)計(jì)是HPMA藥物靶向輸送系統(tǒng)中控制靶向/釋放的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，寡肽側(cè)鏈常被用于作為藥物粘結(jié)/釋放的位點(diǎn)。例如HPMA－Dox復(fù)合物［8］中出色的針對組織蛋白酶B特異的GFLG肽序列連接結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，在細(xì)胞通過內(nèi)吞作用將大分子物質(zhì)吸收同化并定位到溶酶體聚集的部位后，GFLG裂解釋放藥物;還有設(shè)計(jì)pH值敏感的連接結(jié)構(gòu)，基于對炎癥部位的微環(huán)境研究，炎癥部位酸性環(huán)境可為pH酸性敏感的連接結(jié)構(gòu)提供藥物釋放的場所［9］。在骨靶向藥物 HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物上，體現(xiàn)為－Gly－Gly－Pro－Nle－寡肽連接和1，6自我消除的4－胺芐醇結(jié)構(gòu)(圖中④和⑤)。那是研究者們參照HPMA－Dox的成功經(jīng)驗(yàn)，針對組織蛋白酶K(破骨細(xì)胞特異分泌酶)設(shè)計(jì)的敏感寡肽序列。寡肽片段與PGE1之間用1，6自我消除的4－胺芐醇結(jié)構(gòu)連接，在寡肽片段被組織蛋白酶K降解，胺芐醇發(fā)生1，6自我消除，釋放PGE1。在這個設(shè)計(jì)思路中，胺芐醇與PGE1之間連接的酯鍵(圖1中箭頭)被證實(shí)為是該設(shè)計(jì)的一大缺陷。新的用于替代酯鍵的連接結(jié)構(gòu)和針對骨病理微環(huán)境產(chǎn)生的pH變化敏感的連接結(jié)構(gòu)都在發(fā)展中。

3.3 靶向分子和治療分子的設(shè)計(jì) 靶向骨骼的分子目前按結(jié)合區(qū)域可以分為:①四環(huán)素，鈣黃綠素及其衍生物——針對成骨表面;②D構(gòu)型Asp寡肽(Asp8，Asp6等)——針對破骨表面;③雙磷酸鹽——成骨破骨表面都青睞。

隨著針對骨骼的微環(huán)境，細(xì)胞亞細(xì)胞，分子研究的不斷深入，更多的親骨特性的因子將加入到靶向分子之中。治療分子的選擇今后也將擴(kuò)展到傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的丹參素［21］，蛇床子素［22］，淫羊藿等以及分子醫(yī)藥領(lǐng)域抗DKK1蛋白抗體，SOST硬化蛋白抗體等［23，24］。另外以溶酶體為藥物釋放位點(diǎn)的HPMA－藥物復(fù)合物經(jīng)過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在臨近核區(qū)釋放。我們可以得到啟示，在HPMA上接上針對DNA，RNA的調(diào)控因子，使得調(diào)控因子能夠直接進(jìn)入核區(qū)發(fā)揮作用，這將給一些先天性缺陷疾病帶來福音，但這需要對藥物復(fù)合物在細(xì)胞亞細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸路徑和細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的更多的基礎(chǔ)研究做鋪墊。

HPMA上不斷重復(fù)的結(jié)構(gòu)和N－取代的酰胺鍵，使得一條HPMA側(cè)鏈上除了能添加多個靶向因子和治療因子，還能加上各種示蹤分子［25］，如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)等，展示了可以在一個簡單的結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)各種不同的功能。理想的設(shè)計(jì)是與HPMA接上的不同功能的因子都能夠在合適的階段，合適的部位釋放，發(fā)揮自身固有的作用，而各種因子之間不相互干擾。但是多功能的復(fù)合物，或多或少都對其它分子產(chǎn)生一些影響(包括復(fù)合物分子間和復(fù)合物內(nèi)部的因子之間)。一條HPMA分子上有多個疏水基團(tuán)，分子內(nèi)部或分子間的疏水作用力會讓疏水分子在局部空間上的聚集，形成微團(tuán)結(jié)構(gòu)，這對藥物運(yùn)輸、釋放率都將產(chǎn)生影響，因此在設(shè)計(jì)復(fù)合物時就應(yīng)該考慮到引入每一種因子，復(fù)合物在體內(nèi)的環(huán)境中所能產(chǎn)生的相互作用力對設(shè)計(jì)目的的影響。復(fù)合物的分子內(nèi)部和分子間的相互作用，主要由復(fù)合物鏈的大小和構(gòu)型，疏水結(jié)構(gòu)/分子的類型、含量以及在復(fù)合物中的位置，復(fù)合物的濃度以及其他因素(溫度，溶劑，pH值等)的影響［2］。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在模擬藥物設(shè)計(jì)中的運(yùn)用，結(jié)合多種物理檢測技術(shù)，將會指導(dǎo)和優(yōu)化特定復(fù)合物的設(shè)計(jì)。

3.4 展望 經(jīng)過30多年的發(fā)展，HPMA經(jīng)受了時間的考驗(yàn)，展示了出色的生物相容性，分子載入的多功能性和完善發(fā)展的聚合物合成體系，使HPMA從眾多聚合物載體中脫穎而出，成為研究的熱點(diǎn)。大量的基礎(chǔ)研究和新的HPMA復(fù)合物目前集中在癌癥領(lǐng)域，對除癌癥之外的疾病尤其是在骨骼與肌肉疾病方面的研究和新的復(fù)合物還很少，可以預(yù)見在癌癥之外的疾病領(lǐng)域HPMA將迎來一個新的發(fā)展。

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