注射用緩釋微球的體外釋放度研究

彭 芳，周鳳梅，劉萬卉

(1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005;2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264003)

由于新化合物藥物研發(fā)風險大，投資大，時間長，因此進行給藥系統(tǒng)研究是目前各大制藥公司的研究熱點。注射用緩釋微球是非腸釋藥系統(tǒng)(Parenteral depot system，PDS)中的一種。微球所用的聚合物載體有合成聚合物與天然聚合物兩種［1］，目前常用的是合成聚合物中的生物可降解型。藥物溶解或分散在聚合物基質中，可降解性聚合物在人體內經水解或酶解可降解為無毒性可吸收的小分子。作為緩釋靶向制劑，微球對于改善老年人、精神類疾病患者的順應性有非常積極的作用?；谖⑶蛑苿┍旧淼奶攸c(可能會發(fā)生突釋)，臨床也對微球制劑的質量控制尤其是釋放性質提出了較高的要求，依據美國藥物科學家協(xié)會(American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS)美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)和美國藥典委員會(U-nited States Pharmacopoeia，USP)2001年4月在華盛頓召開的“非腸道持續(xù)釋放及控制釋放系統(tǒng)質量控制及實施”專題會議的總結報告［2］以及近年來的國內外微球研究的相關文獻，本文就注射用微球質量控制主要指標釋放度進行了綜述。

目前釋放度的檢查方法，美國藥典收載了7種，包括籃法(Basket)、漿法(Paddle)、往復筒法(Reciprocating Cylinder)、流池法(Flow Through Cell)、槳碟法(Paddle Over Disk)、轉筒法(Rotating Cylinder)和往復碟法(Reciprocating Disk)?！吨袊幍洹?010年版收載的釋放度方法則包括籃法、槳法和小杯法。由于注射用緩釋微球長效緩釋的特性，每一支含藥量相當于常規(guī)制劑的數(shù)十至數(shù)百倍，單支價值很高;同時適合制成微球的藥物往往計量比較低，造成常規(guī)測定過程中釋放后藥液濃度低。因此從科學性和檢驗經濟學兩方面來說，常規(guī)制劑釋放度測定使用的籃法、槳法和小杯法無法滿足注射用微球制劑釋放度測定的要求。因此微球制劑通常采用直接釋藥法(sample and separate methods)、透析膜擴散法(membrane diffusion method)、流池法(Continuous flow － through method)［3］等。

除測定方法外，釋放介質和釋放溫度也是影響釋放度測定結果的重要因素。鑒于微球制劑具有長效緩釋的特點，在接近體溫的37℃條件下其釋放時間較長，時間長達數(shù)周至數(shù)月，為了提高檢驗效率，達到縮短時間的目的，可通過提高溫度的辦法來實現(xiàn)。要考慮體內和體外釋放度的相關性［4］，以及提高溫度進行加速釋放后，加速釋放與37℃條件下釋放度曲線的相關性。

1 測定方法

1.1 直接釋藥法 將一定量的微球直接置入一定體積的介質中，在一定頻率下振蕩，定時取樣，在取樣的同時補充相應的新鮮介質或在測試后再將取出的介質放回去。本方法的優(yōu)點是操作較為簡便，成本低;主要缺點是取樣過程中很難避免微球的損失，此外隨著聚合物酸性降解產物的形成和積累，介質的pH值可能會持續(xù)下降。目前上市的微球制劑的釋放度檢查大多使用該法。

Yen等［5］對納布咖丙酸鹽可生物降解微球的體內外釋放進行了研究，其中體外釋放采用37℃下40 rpm的具塞錐形瓶進行水浴搖床(直接釋放法的一種)，用400 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4，0.025 M)作為釋放介質，在0，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72 和96 h 時間點取樣并立即補充等量的新鮮緩沖液。取出的樣品經5 μm濾膜過濾后用HPLC法進行測定。在96 h時藥物釋放了約71.1%，釋放曲線見圖1。

圖1 納布咖丙酸鹽可生物降解微球體外釋放曲線

Mu等［6］對以PLGA為載體的紫杉醇微球的體外釋放進行了研究，采用37℃下130 rpm轉速水浴，用磷酸鹽緩沖液作為釋放介質，在特定時間點取樣并立即補充等量的新鮮緩沖液。

Xue等［7］采用37℃下pH 7.4的PBS作為釋放介質測定PLGA/介孔二氧化硅混合結構藥物釋放，每隔一天取樣釋放液并補充新鮮緩沖液。

楊陽等［8］采用搖瓶培養(yǎng)法(即水浴搖床，直接釋放法的一種)測定鹽酸噻吩諾啡微球的體外釋放度:取樣品10 mg，置于50 mL三角瓶中，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(含0.02% 疊氮化鈉)30 mL，置于溫度為(37.0±1.0)℃，速度為120 r·min－1的恒溫振蕩儀中，定時取樣1 mL，同時補充介質1 mL。用HPLC法測定介質中藥物的含量，計算累積釋放度。

1.2 透析膜擴散法 將藥物微球放入透析袋(管)［9～12］，置于相應介質中進行測試，該方法有利于透析膜外介質的交換，可避免樣品處理過程中微球的損失和釋放介質pH的改變，但操作的成本比直接釋藥法高。

Kostanski等［7］采用透析法測定微球的體外釋放度，在7 mL透析管中加入微球和pH 4.0的醋酸鹽緩沖液(0.1 M)5.0 mL，將透析管放入裝有40 mL同樣釋放介質的50 mL外管中，外管中放置磁力攪拌器(見圖2)。在每個時間點從50 mL外管中取樣1.0 mL，并補充1.0 mL新鮮緩沖液。樣品采用HPLC法測定，結果表明用透析法能獲得更好的體內外相關性。

Park等［8］將樣品溶液置于Spectra/por透析袋中，透析袋內外釋放介質采用PBS，在37℃下進行微球的釋放度測定。

圖2 透析法測定體外釋放度的裝置

符旭東等［10］比較了石杉堿甲緩釋微球采用透析釋藥和直接釋藥兩種方法測定釋放度。結果發(fā)現(xiàn)直接釋藥法所獲得的體外釋放度數(shù)據雖略低于透析袋法，但這種損失對結果不造成顯著影響(結果見圖3)。

圖3 直接釋藥法和透析釋藥法對石杉堿甲緩釋微球體外釋放度的影響

1.3 流池法［13～16］儀器由溶劑存儲瓶、恒流活塞泵、溫控流通池、濾過系統(tǒng)、取樣系統(tǒng)和樣品收集器組成?；驹頌槿苊酵ㄟ^氣泵的壓力從儲液泵中抽取，往復通過放有樣品的樣品池。流通池法具體分為兩種，一種是循環(huán)式流通池法(閉合式系統(tǒng)，與傳統(tǒng)溶出度方法接近)，是將樣品置于特別設計的流通池中的樣品架上，溶劑應預先加熱至37℃，由恒流泵泵入。溶劑經過裝有恒溫裝置的熱交換器的水浴，進入流通池的下端溫度37℃，流速可調節(jié)(2～50 mL·min－1)，與樣品接觸，并由流通池的上端濾過后流出。另一種是開放式流通池法(開放式系統(tǒng))，與閉合式系統(tǒng)的主要區(qū)別是溶出介質通過流通池后不再返回，在通過流通池后使用自動取樣裝置按時間點進行取樣，其特點是使大量新鮮的溶出介質不斷地經過被測樣品，使樣品隨時與新鮮溶出介質接觸，而使藥物逐漸溶解到最后溶盡為止，能夠一直保持適宜的漏槽條件，適合溶解度非常小的藥物［13］。本方法能較好地模擬體內環(huán)境，其缺點是設備較為復雜，成本較高。裝置見圖4。

圖4 USP第四法裝置圖

Voisine等［14］采用USP第四法(流池法)測定微球的體外釋放度，裝置選用Sotax CE 7 smart溶出儀，含水槽、泵、1 mm玻璃微珠的流通池(直徑12 mm)，流通池上裝有0.45 μm玻璃纖維濾紙。37℃下，采用磷酸鹽緩沖液(pH=7.4，0.1 M)作為釋放介質，流速為 16 mL·min－1。

Zolnik等［15］采用USP第四法(流池法)測定地塞米松微球的體外釋放度，裝置選用Sotax CE 7 smart溶出儀或CY 7活塞泵，含1 mm玻璃微珠的流通池(直徑12 mm)，流通池上裝有0.45 μm玻璃纖維濾紙。37℃下，采用含0.1%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4，0.1 M)作為釋放介質，流速為20 mL·min－1。測定結果見圖5。

圖5 37℃下，地塞米松的PLGA微球在磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中釋放結果。(◆)采用相對分子量28k的PLGA制成的微球，(■)采用相對分子量13k的PLGA制成的微球

鑒于上述釋放度測定方法各有優(yōu)劣，選擇方法時應綜合考慮測定準確性、操作的簡便性和試驗成本等。

2 介質的選擇

介質的pH值、離子強度以及加入的表面活性劑會影響藥物的溶解度、穩(wěn)定性及聚合物降解速度。長效注射微球一般采用肌注或皮下注射，而組織環(huán)境的pH為7左右，所以常采用的介質pH為7.4;常用的釋放介質為磷酸鹽緩沖液(PBS)［3～5，9，10，12～33］，如果藥物的溶解度較低，可加入表面活性劑 SDS［3］或吐溫 80［6，17，18，20，24］助溶，也有采用甲醇作為釋放介質，如曲普瑞林微球。釋放介質的選擇應以體內外釋放擬合結果為準，因此曲普瑞林微球采用甲醇而非常規(guī)的PBS，推測主要是由于采用甲醇得到的釋放與體內結果更接近。

測定介質的體積，通常遠小于常規(guī)的溶出度測定法，可以只有幾十毫升，乃至幾毫升，但必須滿足漏槽狀態(tài)。由于微球釋放時間較長，因此與普通制劑的區(qū)別在于釋放介質中加入疊氮化鈉抑菌［17，18，20］，以避免釋放度測定的過程中釋放介質發(fā)生變化。

3 溫度的選擇

測定溫度一般為37℃，采用加速試驗的方法可以快速考察微球的體外釋藥行為［19，34］。有研究表明在pH 4的介質中相對分子質量為8600和28000的PLGA微球在50℃和60℃ 時，多肽藥物可在30～40 h內完全釋放，與體外37℃，pH 7.0介質中的真實釋放時間相關性良好［34］。對于相對分子質量更高的聚合物，延長和提高加速試驗的時間和溫度，也能與真實時間的釋放保持好的相關性。

4 體內外相關性

體內外相關性(in vitro－in vivo corelations，IVIVC)是用數(shù)學模型描述藥物體外性質(藥物溶出的速率或程度)與體內特性(血藥濃度或藥物吸收量)的關系［11］。IVIVC既可以作為藥品質量的評價方法，也可用于替代考察該劑型的體內生物學表現(xiàn)。鑒于IVIVC能夠減少體內研究(人體和動物)數(shù)量，因此具有非常重要的意義［35］。結合體內外相關性的研究結果，篩選出最適宜的體外釋放條件［18］。

圖6 石杉堿甲緩釋微球體內外釋放相關性(●pH 4.0體外釋放，▲ pH 7.4體外釋放，■體內釋放)

5 總結

作為長效緩釋制劑，體外釋放度是一個很重要的質量控制指標，在研發(fā)過程中能夠用來監(jiān)測批間差異、評價生產過程中的可能變化以及優(yōu)化處方等［3］。關于微球體外釋放度測定的方法，一般采用使體外釋放條件盡可能地模擬體內的方法，所選擇的方法和條件滿足體內外相關性好這一基本原則。此外，由于注射用緩釋微球劑型的特殊性，其釋放度測定周期較長，為了在日常檢驗工作中更加方便快捷，有必要建立體外釋放度的加速試驗方法。

［1］Alagusundaram M，Madhu Sudana Chetty C，Umashankari.K，et al.MICROSPHERES AS A NOVEL DRUG DELIVERY SYSYTEM － A REVIEW［J］.International Journal of ChemTech Research，2009，1(3):526 －534.

［2］Burgess DJ，Crommelin DJ，Hussain AS，et al.Assuring quality and performance of sustained and controlled release parenterals:EUFEPS workshop report［J］.AAPS PharmSci，2004，6(1):E11.

［3］Rawat A，Burgess DJ.USP apparatus 4 method for in vitro release testing of protein loaded microspheres［J］.Int J Pharm，2011，409(1 －2):178 －184.

［4］Vlugt－ Wensink KD，de Vrueh R，Gresnigt MG，et al.Preclinical and clinical in vitro in vivo correlation of an hGH dextran microsphere formulation［J］.Pharm Res，2007，24(12):2239－2248.

［5］Yen SY，Sung KC，Wang JJ，et al.Controlled release of nalbuphine propionate from biodegradable microspheres:in vitro and in vivo studies［J］.Int J Pharm，2001，220(1－2):91－99.

［6］Mu L，F(xiàn)eng SS.Fabrication，characterization and in vitro release of paclitaxel(Taxol)loaded poly(lactic－coglycolic acid)microspheres prepared by spray drying technique with lipid/cholesterol emulsifiers［J］.J Control Release，2001，76(3):239 －254.

［7］J.M.Xue，M.Shi.PLGA/mesoporous silica hybrid structure for controlled drug release［J］.J Control Release，2004;98(2):209－217.

［8］楊陽，高永良.制備工藝對鹽酸噻吩諾啡微球體外釋放度的影響［J］.中國新藥雜志，2011，20(3):267 －269.

［9］Kostanski JW，DeLuca PP.A novel in vitro release technique for peptide containing biodegradable microspheres［J］.AAPS PharmSciTech，2000，1(1):E4.

［10］Park TG，Lu W，Crotts G.Importance of in vitro experimental conditions on protein release kinetics，stability and polymer degradation in protein encapsulated poly(D，L －lactic acid －co－glycolic acid)microspheres［J］.Journal of Controlled Release，1995，33(2):211 －222.

［11］Ma L，Liu M，Liu H，et al.In vitro cytotoxicity and drug release properties of pH－ and temperature－sensitive core– shell hydrogel microspheres［J］.Int J Pharm，2010，385(1－2):86－91.

［12］符旭東，高永良，平其能，等.石杉堿甲緩釋微球的體外釋放度及其體內外相關性研究［J］.醫(yī)藥導報，2005，24(11):994－996.

［13］孫悅.流通池法控制制劑釋放的應用前景及體內外相關性的探討［J］.天津藥學，2010，22(5):53－57.

［14］Voisine JM，Zolnik BS，Burgess DJ.In situ fiber optic method for long－term in vitro release testing of microspheres［J］.Int J Pharm，2008，356(1 －2):206 －211.

［15］Zolnik BS，Burgess DJ.Evaluation of in vivo – in vitro release of dexamethasone from PLGA microspheres［J］.Journal of Controlled Release，2008，127(2):137 －145.

［16］Mallardé D，Boutignon F，Moine F，et al.PLGA – PEG microspheres of teverelix:influence of polymer type on microsphere characteristics and on teverelix in vitro release［J］.Int J Pharm，2003，261(1 －2):69 －80.

［17］Park EG，Na DH，Lee KC.In vitro release study of mono－PEGylated growth hormone－releasing peptide－6 from PLGA microspheres［J］.Int J Pharm，2007，343(1 － 2):281－283.

［18］Liu WH，Song JL，Liu K，et al.Preparation and in vitro and in vivo release studies of Huperzine A loaded microspheres for the treatment of Alzheimer's disease［J］.Journal of Controlled Release，2005，107(3):417 －427.

［19］符旭東，高永良.緩釋微球的釋放度試驗及體內外相關性研究進展［J］.中國新藥雜志，2003，12(8):608－611.

［20］Sun Y，Wang J，Zhang X，et al.Synchronic release of two hormonal contraceptives for about one month from the PLGA microspheres:in vitro and in vivo studies［J］.Journal of Controlled Release，2008，129(3):192 －199.

［21］Mundargi RC，Shelke NB，Rokhade AP，et al.Formulation and in－vitro evaluation of novel starch－based tableted microspheres for controlled release of ampicillin［J］.Carbohydrate Polymers，2008，71(1):42 －53.

［22］Sivakumar M，Panduranga Rao K.Preparation，characterization and in vitro release of gentamicin from coralline hydroxyapatite － gelatin composite microspheres［J］.Biomaterials，2002，23(15):3175 －3181.

［23］Babu VR，Sairam M，Hosamani KM，et al.Development of 5－fluorouracil loaded poly(acrylamide－co－methylmethacrylate)novel core－shell microspheres:in vitro release studies［J］.Int J Pharm，2006，325(1 －2):55 －62.

［24］Schaefer MJ，Singh J.Effect of tricaprin on the physical characteristics and in vitro release of etoposide from PLGA microspheres［J］.Biomaterials，2002，23(16):3465 －3471.

［25］Choi HS，Seo SA，Khang G，et al.Preparation and characterization of fentanyl－loaded PLGA microspheres:in vitro release profiles［J］.Int J Pharm，2002，234(1 － 2):195－203.

［26］Li H，Chang J.Preparation，characterization and in vitro release of gentamicin from PHBV/wollastonite composite microspheres［J］.Journal of Controlled Release，2005，107(3):463－473.

［27］Gomez C，Blanco MD，Bernardo MV，et al.Cytarabine release from comatrices of albumin microspheres in a poly(lactide–co－glycolide)film:in vitro and in vivo studies［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，57(2):225 －233.

［28］Gao P，Ding P，Xu H，et al.In vitro and in vivo characterization of huperzine a loaded microspheres made from end－ group uncapped poly(d，l－ lactide acid)and poly(d，l－lactide－co－ glycolide acid)［J］.Chem Pharm Bull，2006，54(1):89 －93.

［29］Dong CM，Guo YZ，Qiu KY.et al.In vitro degradation and controlled release behavior of D，L－PLGA50 and PCL－b－ D，L － PLGA50 copolymer microspheres［J］.Journal of Controlled Release，2005，107(1):53 －64.

［30］Wang SH，Zhang LC，Lin F，et al.Controlled release of levonorgestrel from biodegradable poly(D，L－lactide－co－glycolide)microspheres:in vitro and in vivo studies［J］.Int J Pharma，2005，301(1 －2):217 －225.

［31］Shen B，Pei FX，Duan H，et al.Preparation and in vitro activity of controlled release microspheres incorporating bFGF［J］.Chinese Journal of Traumatology，2008，11(1):22－27.

［32］Naraharisetti PK，Lew MD，F(xiàn)u YC，et al.Gentamicin －loaded discs and microspheres and their modifications:characterization and in vitro release［J］.Journal of Controlled Release，2005，102(2):345 －359.

［33］Gao P，Xu H，Ding P，et al.Controlled release of huperzine A from biodegradable microspheres:In vitro and in vivo studies［J］.Int J Pharm，2007，330(1 －2):1 －5.

［34］Shameem M，Lee H，DeLuca PP.A Short－term(accelerated release)approach to evaluate peptide release from PLGA depot formulations［J］.AAPS Pharmsci，1999，1(3):E7.

［35］Cheung RY，Kuba R，Rauth AM.A new approach to the in vivo and in vitro investigation of drug release from locoregionally delivered microspheres［J］.Journal of Controlled Release，2004，100(1):121－133.