抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米不同DNA提取方法及PCR檢測

楊慧珍，車 麗，任志強，肖建紅

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

雜草為害是造成玉米（Zeamays L.）減產(chǎn)的重要因素之一。植物基因工程技術(shù)的誕生和發(fā)展，為玉米抗除草劑育種提供了一條有效的途徑[1]。

李敬娜等[2]以pCambia3301載體為基礎(chǔ)，以玉米Ubiquitin（Ubi）啟動子、擬南芥葉綠素轉(zhuǎn)運肽（Chloroplast transit peptide，Ctp）基因、抗草甘膦Epsps基因為元件，構(gòu)建了玉米高效雙元表達載體，通過凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米幼胚，獲得了抗草甘膦無抗生素標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米植株。馬云霞等[3]采用根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)法將抗草甘膦基因（sxglr-11）導(dǎo)入優(yōu)良玉米再生系HiII，獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。關(guān)于抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米的研究，Sawahel[4]用電擊法將bar基因?qū)肓擞衩子着咧校@得了抗除草劑玉米材料。李國圣等[5]利用基因槍法將als基因?qū)肓擞衩子鷤M織中，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米。朱常香等[6]利用基因槍法將bar基因?qū)肓擞衩鬃越幌档挠着咧?，獲得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米自交系。bar基因轉(zhuǎn)化水稻等[7]也獲得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。bar基因（bialaphos resistance gene）編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT），而PAT蛋白能使除草劑草丁膦（glufosinate）脫毒，從而使轉(zhuǎn)bar基因的作物具有抗除草劑的性狀[8]。

用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米已有不少報道，包括常規(guī)PCR檢測[9]、定性PCR檢測[10]、多重PCR檢測[11]和實時定量PCR檢測[12]等。

本研究通過不同植物總DNA的提取方法，對轉(zhuǎn)基因材料PCR分析時設(shè)置內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，探討和分析其PCR擴增產(chǎn)物的大小及序列準(zhǔn)確性，建立一個快速、有效的轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的檢測方法，旨在為有關(guān)研究提供一定的理論及技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料為花粉介導(dǎo)法導(dǎo)入bar基因（啟動子為CaMV35S啟動子）到玉米自交系黑玉2號所獲得的轉(zhuǎn)基因種子，它來自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩鬃越幌岛谟?號種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供。

1.2 引物的設(shè)計與合成

CaMV35S啟動子引物序列、玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Zein引物序列和外源基因bar基因引物序列如表1所示。所用引物均由上海生工生物工程公司合成，用TE稀釋為100mmol/L。

表1 引物序列及擴增片斷長度

1.3 總DNA提取

將玉米種子研磨成細粉，裝入2mL離心管中，用改良 PEX法、CTAB法[13]和 SDS法[14]分別提取總DNA。

改良PEX提取方法為：每管分別加入PEX提取液 （PEX 12.5mmol/L；Tris-Cl 100mmol/L；NaCl700mmol/L；EDTA 10mmol/L（pH 值 8.0）；PVP 6%）500μL，于65℃水浴中保溫20min；然后分別加入400μL Tris飽和酚，400μL氯仿/異戊醇（24∶1，V/V），輕輕顛倒混勻，冰浴放置5min，11 000 r/min離心10min；取上清液至另一2mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻，冰浴放置5min，11 000 r/min離心10min；再取上清液至新的2mL離心管中，加入1/10體積的5mol/L乙酸鈉，混勻數(shù)分鐘后，加入9/10體積的冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min，然后13 000 r/min離心12min；棄上清，加入200μL 70%乙醇，顛倒數(shù)次漂洗沉淀，13 000 r/min離心1min。同樣方法再用70%乙醇漂洗1次；待乙醇蒸發(fā)完后，加入40μL TE緩沖液，溶解DNA。

于0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取DNA的效果，用核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度，并用1×TE將總DNA稀釋至100 ng/μL備用。

陽性對照DNA按照分子克隆實驗指南[15]進行。

1.4 PCR擴增

建立PCR擴增體系：體積20μL，10×緩沖液（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.6 μL，模板DNA 2.0μL，引物各0.8μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，用無菌去離子水定容至20μL。反應(yīng)在PT-100型PCR儀上進行。試驗設(shè)陰性對照和空白對照。

擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，退火1min，72℃延伸1min，進行35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。不同引物的退火溫度分別為：CaMV35S啟動子55℃，Zein基因55℃，bar基因55℃。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴增產(chǎn)物8μL，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（含溴化乙錠），用DL 2 000 DNA Marker為參照判斷擴增產(chǎn)物的大小，用SYN凝膠成像系統(tǒng)照相。當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致時，用生工公司生產(chǎn)的回收試劑盒回收DNA，并送生工公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA的純度和濃度

首先用SDS，CTAB和改良PEX 3種方法分別提取3份DNA樣品，所提取的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，SYN成像系統(tǒng)觀察（圖1），發(fā)現(xiàn)這3種方法所提取DNA在凝膠上形成一條整齊的條帶，除CTAB法提取的DNA在前方有少量RNA污染物出現(xiàn)外，其他2種方法提取的DNA質(zhì)量都較高。

經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定，這3份DNA的質(zhì)量濃度達到 600～800μg/mL，OD260/OD280值在2.0左右，OD260/OD230值在1.6～1.8之間，均達到對DNA進行分析的要求（表2）。但綜合這3種植物DNA提取方法，按一個流程計，PEX方法比SDS方法節(jié)省0.45 h，比CTAB方法節(jié)省2.0 h。

表2 提取DNA在核酸蛋白檢測儀上的測定結(jié)果

本著檢測方法快速、準(zhǔn)確的特點，本研究選用PEX法提取其余植物材料DNA，并做進一步的PCR分析。

2.2 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測方法建立

用CaMV35S和bar引物進行PCR擴增的結(jié)果如圖2所示。不含模板DNA的空白對照無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR操作過程無污染。用Zein引物從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因黑玉2號均擴增出151 bp的產(chǎn)物，這與玉米中Zein片段的大小一致，說明從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀娃D(zhuǎn)基因玉米中所提取的DNA能有效地進行PCR擴增。用CaMV35S和bar引物擴增時，產(chǎn)物與預(yù)期大?。?95，552 bp）相似，說明用這2對引物能從轉(zhuǎn)基因玉米中擴增出目標(biāo)片段。

為了驗證擴增片段是否為目的基因，將用CaMV35S啟動子和bar基因引物從轉(zhuǎn)基因植物中擴增的片段分別回收測序，將測序結(jié)果用Blast進行同源性分析。從擴增片段與全長bar基因極高的相似性可以看出，擴增片段為CaMV35S啟動子和bar基因，用這2對引物從轉(zhuǎn)基因植物中擴增出了目標(biāo)基因，因此，可以用這2對引物鑒定抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米。

3 討論

關(guān)于植物基因工程，轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、非組培法[16]等，所獲得轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的快速檢測也有不少報道，主要是建立適合PCR分析的植物總DNA的快速提取方法[17]。

本研究采用3種方法分別提取植物總DNA，其中，改良PEX法每個流程比SDS法節(jié)省0.45 h，比CTAB法節(jié)省2.0 h，而且提取的DNA的濃度、純度測定結(jié)果顯示均可滿足PCR檢測分析及其他分子檢測的要求，且PCR檢測結(jié)果也符合預(yù)期目的。改良PEX提取DNA結(jié)合PCR檢測，無疑是一種快速、有效的轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的檢測方法。

［1］宋小玲，強勝，劉琳莉，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物基因流及其安全性評估方法的探討 [J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境，2005，21（3）：74-77.

［2］李敬娜，劉亞，李翔，等.抗草甘膦基因表達載體的構(gòu)建及對玉米的遺傳轉(zhuǎn)化[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（4）：44-48.

［3］馬云霞，王秀紅，白建榮，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗草甘膦基因（sxglr-11）的玉米遺傳轉(zhuǎn)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：13-16.

［4］SawahelW A.Production ofherbicide-resistant transgenicmaize plants using electroporation of seed-derived embryos[J].Plant Molecular Biology Reporter，2002，20（3）：303-304.

［5］李國圣，楊愛芳，張舉仁，等.玉米愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及抗除草劑植株再生[J].科學(xué)通報，2000，45（20）：2181-2184.

［6］朱常香，宋云枝，張杰道，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的獲得及遺傳研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，33（2）：120-125.

［7］孫海波，李艷萍，鄒美智，等.提高轉(zhuǎn)bar基因雜交粳稻大田純度的試驗[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，10（2）：13-16.

［8］劉洪艷，弭曉菊，崔繼哲.bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性與安全性[J].生態(tài)學(xué)雜志，2007，26（6）：938-942.

［9］陳穎，陳哲，徐寶梁，等.玉米加工食品中轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測[J].糧食與飼料工業(yè)，2003（2）：44-46.

［10］袁磊，趙蕾，孫紅煒，等.轉(zhuǎn)基因玉米的定性PCR檢測[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（11）:8-10.

［11］邵碧英，陳文炳.玉米及其制品中轉(zhuǎn)基因成分的單一PCR及多重 PCR 檢測[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：380-384.

［12］曹際娟，覃文，朱水芳，等.用實時熒光PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因玉米 T14/T25[J].遺傳，2004，26（5）：689-694.

［13］王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2002：743-744.

［14］王景雪，孫毅，高武軍.一種簡便實用的植物總DNA提取方法[J].山西大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2000，23（3）：271-272.

［15］Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1992：19-24.

［16］任海紅，任小俊，王英，等.非組培遺傳轉(zhuǎn)化法在農(nóng)作物上的應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（11）：85-88.

［17］孟祥棟，馬紅，蓋樹鵬.快速提取用于PCR分析的幾種蔬菜 DNA的方法 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1998，4（3）：251-254.