日本薯蕷脫毒培養(yǎng)及離體高效快繁體系的建立

解曉紅，陳 麗，裴 蕾，李江輝，李 波，解紅娥，武宗信

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

日本薯蕷（Rhizoma Dioscoreae）為薯蕷科植物，屬多年生纏繞草本，我國(guó)除少數(shù)熱帶地區(qū)外，幾乎各地都有種植。薯蕷塊莖藥用價(jià)值很高，被醫(yī)學(xué)家稱(chēng)為“理虛之要藥”，“滋補(bǔ)藥中的上品”。《本草綱目》認(rèn)為，薯蕷能“益腎氣，健脾胃，止瀉痢，化痰涎，潤(rùn)皮毛”。薯蕷營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含粗蛋白、氨基酸、維生素、淀粉和糖等[1]。日本薯蕷外形粗壯，通體筆直，均勻美觀，產(chǎn)量高，我國(guó)每年出口到日本、韓國(guó)的干、鮮貨可達(dá)10萬(wàn)t以上，而且供不應(yīng)求。但由于多年的傳統(tǒng)種植，近年來(lái)日本薯蕷品種退化、病毒為害嚴(yán)重，表現(xiàn)癥狀為葉色失綠、花斑葉、葉畸形；地下塊莖明顯變小、畸形，產(chǎn)量下降，品質(zhì)不高，嚴(yán)重時(shí)整株矮化，生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。目前，大田中已發(fā)現(xiàn)的病毒有山藥壞死花葉病毒（Chineseyam necroticmosaicvirus）、山藥綠色斑駁病毒（Yam green-bandingvirus）、日本山藥花葉病毒（Japanese yammasaic virus）、馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf rollvirus）、馬鈴薯A病毒（Potato Virus A）、馬鈴薯 M病毒（Potato VirusM）、馬鈴薯 S病毒（Potato Virus S）和馬鈴薯X病毒（Potato Virus X）等[2-3]。目前，在無(wú)任何特效藥劑防治病毒病的情況下，利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立薯蕷脫毒培養(yǎng)和離體高效快繁技術(shù)體系，是日本薯蕷去除病毒、恢復(fù)種性、增加產(chǎn)量、提高品質(zhì)的最佳途徑[4-11]。

本研究通過(guò)組織培養(yǎng)手段對(duì)日本薯蕷進(jìn)行脫毒及快繁技術(shù)研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

日本薯蕷植株由山西省聞喜縣中藥材種植基地提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 切1 cm左右日本薯蕷莖段，用75%乙醇浸泡30 s，再用不同消毒劑消毒，篩選合適的消毒劑及用量。消毒莖段接種到MS附加不同激素培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲取無(wú)菌苗。

1.2.2 莖尖培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，切取日本薯蕷無(wú)菌苗0.2～0.4mm莖尖，每個(gè)莖尖帶2個(gè)葉原基，然后轉(zhuǎn)入MS附加不同外源激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每瓶接種1個(gè)莖尖，接30瓶。90 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 電鏡觀測(cè)法檢測(cè)脫毒莖尖苗 將待測(cè)莖尖苗汁液滴在覆膜銅網(wǎng)上制作樣本，電鏡觀測(cè)到病毒質(zhì)粒的為帶毒苗。

1.2.4 多芽體誘導(dǎo)進(jìn)行快繁 將莖尖形成的叢生小苗，切成帶有1個(gè)腋芽的莖段，接種到培養(yǎng)基上。40 d后統(tǒng)計(jì)多芽體數(shù)和生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 試管苗快繁培養(yǎng) 將多芽體切成單芽接種到培養(yǎng)基。40 d后統(tǒng)計(jì)苗高、葉片數(shù)、生根數(shù)。

1.2.6 試管苗移栽 薯蕷試管苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)進(jìn)行移栽。

試驗(yàn)中，瓊脂0.7%，pH值為6.0，光強(qiáng)2000～5000 lx，光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)溫度（28±1）℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對(duì)無(wú)菌苗培養(yǎng)的影響

取自大田的外植體含有大量的雜菌，消毒后接種才能長(zhǎng)出無(wú)菌苗。設(shè)計(jì)不同用量和消毒時(shí)間，分別使用HgCl2和NaClO對(duì)來(lái)自大田的外植體進(jìn)行消毒比較試驗(yàn)，結(jié)果（表1）表明，用0.1%HgCl2消毒6～8min效果好，污染率控制在20%以下，成活率達(dá)80%～90%；用0.1%HgCl2消毒時(shí)間超過(guò)10min時(shí)，因HgCl2殺傷力強(qiáng)，消毒后不易消除，容易殺傷植物組織，死亡率增大；用0.1%HgCl2消毒小于 6 min或用 0.05%HgCl2時(shí)，莖段苗成活率雖提高，但難以消除頑固性的雜菌，污染率會(huì)增加。用NaClO消毒，污染率較高，滅菌效果不理想。消毒好的日本薯蕷莖段苗接種到MS附加不同激素培養(yǎng)基上，可獲得無(wú)菌苗。

表1 消毒劑用量及消毒時(shí)間對(duì)莖段苗成活率的影響

2.2 不同外源激素對(duì)日本薯蕷莖尖存活率和芽分化的影響

選擇生長(zhǎng)健壯的薯蕷無(wú)菌苗，在4×10 X解剖鏡下切取0.2～0.4mm莖尖，分別放入MS附加不同質(zhì)量濃度6-BA，NAA，IBA培養(yǎng)基中，莖尖均能啟動(dòng)細(xì)胞分裂，5～7 d莖尖開(kāi)始膨大變綠或脫分化形成半透明顆粒狀愈傷組織，90 d后誘導(dǎo)出的愈傷組織再分化形成高約0.5 cm小苗（表2）。

表2 不同外源激素對(duì)莖尖分化的影響

由表2可知，（1）單一6-BA就能誘導(dǎo)莖尖成苗，隨6-BA質(zhì)量濃度（0.25～1.0mg/L）增大，莖尖存活率和分化出芽數(shù)目增加，但較高質(zhì)量濃度（1.5mg/L）反而不利于莖尖的成活和芽分化；（2）6-BA配合較高質(zhì)量濃度的NAA有利于莖尖分化、長(zhǎng)出多芽和有利于芽的生長(zhǎng)，0.5mg/L 6-BA＋1.5mg/LNAA成苗率達(dá)到 100%；（3）在6-BA質(zhì)量濃度一定的情況下，添加不同質(zhì)量濃度IBA，對(duì)莖尖成苗差異不明顯，但分化出的芽生長(zhǎng)較快，愈傷產(chǎn)生量較小。

2.3 電鏡觀測(cè)法檢測(cè)脫毒莖尖苗

將待測(cè)莖尖苗汁液滴在覆膜銅網(wǎng)上制作樣本，在電鏡觀測(cè)到病毒顆粒的為帶毒苗。去除檢測(cè)出的帶毒苗，剩余的即為脫毒苗，用于進(jìn)一步的脫毒快繁。如果莖尖苗的含病毒顆粒較多，可以再次在4×10X解剖鏡下切取0.2～0.4mm莖尖，進(jìn)行培養(yǎng)后檢測(cè)。如此重復(fù)2～3次可以使脫毒的效果提高到90%以上。

2.4 不同激素配比對(duì)薯蕷莖段快繁多芽體形成的影響

將脫毒的莖尖苗切成帶1個(gè)芽的莖段接種在不同培養(yǎng)基中，其均能分化成多芽或苗（表3）。

表3 不同激素配比對(duì)莖段快繁多芽體形成的影響

接種40 d后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在莖段誘導(dǎo)多芽體形成過(guò)程中，6-BA起著主導(dǎo)作用。在NAA質(zhì)量濃度一定的情況下，隨6-BA濃度增加，多芽體形成增多，如A，B，C培養(yǎng)基中，芽體平均數(shù)由4個(gè)增加到4.8個(gè)，且芽體生長(zhǎng)健壯。在6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度增大，形成芽個(gè)體數(shù)減少，且芽偏白，不利于后期生長(zhǎng)。如A，D，E培養(yǎng)基中，芽體平均數(shù)由4.0個(gè)降至1.9個(gè)。在MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA中，形成的多芽體數(shù)最多，達(dá)到4.8個(gè)，芽體呈綠色，芽體高2～4 cm；在MS＋2.0mg/LKT＋0.2 mg/LNAA中，芽體的分化率雖比較低，但芽體大，苗壯。在MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA基礎(chǔ)上添加IBA對(duì)誘導(dǎo)薯蕷多芽體形成沒(méi)有太大影響。結(jié)果表明，日本薯蕷莖段快繁多芽體誘導(dǎo)以MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA為佳，繁殖系數(shù)大，芽分化和生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.5 不同激素配比對(duì)薯蕷試管苗生根和生長(zhǎng)的影響

將多芽體切成單芽，接種到生根培養(yǎng)基中，40 d后，所有培養(yǎng)基均長(zhǎng)出嫩莖，并長(zhǎng)出新葉，但能生根且生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的只有2種培養(yǎng)基。在試管苗生長(zhǎng)過(guò)程中，較低質(zhì)量濃度的NAA明顯能促進(jìn)生根；6-BA和NAA組合對(duì)叢生芽的形成和生長(zhǎng)有利，而對(duì)生根的效果不明顯，且極易促進(jìn)愈傷的形成，其中6-BA的存在明顯促進(jìn)了芽的生長(zhǎng)和分化；KT和NAA組合培養(yǎng)基中芽分化較少，但試管苗生長(zhǎng)較好，且生根效果明顯；KT/NAA的比值越大，試管苗長(zhǎng)勢(shì)越壯，根系發(fā)育越好，最終選擇MS＋2.0mg/L KT＋0.02mg/LNAA的效果最好；MS＋1.0mg/LKT＋0.2mg/LNAA雖然生根條數(shù)最多，但試管苗長(zhǎng)勢(shì)不好（表4）。消毒大田莖段產(chǎn)生無(wú)菌苗也是接種到這2種培養(yǎng)基上效果較好。

表4 不同激素配比對(duì)試管苗生長(zhǎng)和生根影響

2.6日本薯蕷試管苗的移栽

當(dāng)薯蕷試管苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)進(jìn)行移栽，在培養(yǎng)間28℃左右的條件下，打開(kāi)瓶蓋，逐漸降低濕度，進(jìn)行煉苗，2～3 d后洗凈試管苗根部培養(yǎng)基，移栽到裝有沙、蛭石、泥炭土混合基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽或移栽盤(pán)中，用800～1 000倍移栽液澆灌，并采取適當(dāng)?shù)谋翊胧?，移栽成活率達(dá)85.5%。同時(shí)，移栽時(shí)期以春、秋、冬三季為好，植株成活率高；夏季由于高溫高濕，細(xì)菌繁殖速度較快，容易造成污染，移栽成活率降低。

3 結(jié)論和討論

本研究得出，標(biāo)準(zhǔn)的脫毒快繁程序?yàn)椋合镜那o段在培養(yǎng)上產(chǎn)生無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗0.2～0.4 mm莖尖接種到MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.5 mg/LNAA，進(jìn)行病毒檢測(cè)并剔除帶毒莖尖苗，脫毒莖段接種到MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA進(jìn)行誘導(dǎo)多芽體快繁，多芽體分割成單芽在MS＋2.0mg/LKT＋0.02mg/LNAA上進(jìn)行誘根和生長(zhǎng)，生根的再生植株移栽到大田。

本試驗(yàn)只是確定了脫毒的流程，獲得了移栽到大田的脫毒植株，在生產(chǎn)上的應(yīng)用和表現(xiàn)以及推廣工作還有待于進(jìn)一步研究。

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