飼料中四環(huán)素類抗生素的放射免疫分析

成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 周 浩 李俊霞 楊 紅 肖全偉

四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，由于具備抗菌譜廣以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于畜禽、水生動(dòng)物和蜜蜂養(yǎng)殖中（賈久滿等，2007）。四環(huán)素類抗生素對(duì)于呼吸道和消化道疾病有很好的預(yù)防作用，促進(jìn)生長(zhǎng)作用效果較好，但容易被消化道吸收而殘留在畜禽產(chǎn)品中，因此會(huì)嚴(yán)重危及人類的身體健康。四環(huán)素類藥物的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)在對(duì)胃、腸、肝臟、腎臟的損害以及對(duì)牙齒和骨骼的破壞，最顯著的殘留毒性是誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生（李俊所等，2002）。目前四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法有微生物法、酶聯(lián)免疫方法、高效液相色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用法 （閆小峰，2010；杜紅鴿等，2008；王晶等，2002）等，雖然這些方法都準(zhǔn)確可靠，但成本昂貴，前處理繁瑣復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法縮短陰性樣品的檢測(cè)時(shí)間，遠(yuǎn)不能滿足大批量樣品快速檢測(cè)的需要；放射免疫法結(jié)合了微生物法的準(zhǔn)確與免疫法的高效，可用來(lái)快速篩選飼料中四環(huán)素族藥物殘留。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種可靠、特異性強(qiáng)的放射免疫法用于飼料中四環(huán)素類抗生素的日常檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

1.1.1 儀器和設(shè)備 Charm II 7600分析儀，渦旋振蕩器，電熱恒溫器，專用硼硅玻璃試管及試管塞，精密pH試紙（5.0～10.0），離心機(jī)，微量移液器等。

1.1.2 試劑 四環(huán)素類抗生素檢測(cè)試劑盒及閃爍液，提取緩沖溶液，多抗標(biāo)準(zhǔn)品，緩沖液M2、陰性組織提取物，以上試劑均由Charm公司試劑盒提供。

四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：四環(huán)素、土霉素、金霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、青霉素G等標(biāo)準(zhǔn)品，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于Sigma公司。

1.1.3 試驗(yàn)樣品 市場(chǎng)購(gòu)買飼料20組，四環(huán)素類抗生素留檢陽(yáng)性樣品10組及陰性樣品40組。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)試原理 放射免疫原理基于兩個(gè)方面，其一：每類抗生素族均是在一個(gè)母環(huán)基礎(chǔ)上用不同的功能團(tuán)修飾形成特定功效的抗生素。其二：微生物細(xì)胞表面都存在著能與抗生素功能基團(tuán)結(jié)合的特異受體（王晶等，2002）。因此該法測(cè)定的基礎(chǔ)是競(jìng)爭(zhēng)性受體免疫反應(yīng)，使用兩種試劑:一種是被[3H］標(biāo)記的四環(huán)素，另一種是四環(huán)素藥物結(jié)合試劑（微生物細(xì)胞上的特異性受體）。當(dāng)樣品中含有四環(huán)素類抗生素殘留時(shí)，殘留物與結(jié)合試劑受體上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止了[3H］標(biāo)記的四環(huán)素與結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。[3H］標(biāo)記的四環(huán)素結(jié)合越多，則樣品中四環(huán)素類抗生素殘留越少。用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定樣品中的[3H］的（每分鐘脈沖數(shù)）[cpm]值，cpm值越大，樣品中的四環(huán)素類抗生素殘留量越低（陸勤等，2007；鄭晶等，2005）。

1.2.2 樣品處理 稱取1 g飼料于帶蓋樣品管，做好標(biāo)記；加10 mL MSU提取緩沖液至樣品管中，旋渦振蕩15 s。用pH試紙測(cè)試pH值，滴加M2緩沖液，直到將pH值調(diào)至7.5，此液為待測(cè)液。

1.2.3 測(cè)定步驟 取出檢測(cè)試劑盒，用壓桿將白色藥片（微生物受體）推出到空的試管中；用加液器取300 μL溫水至管中，用旋渦振蕩混合10 s將藥片打碎；用移液器加5 mL樣品，接著將橙色藥片（[3H］標(biāo)記的四環(huán)素抗體）推至試管中；用混合器混合15 s；在36℃的孵育器孵育5 min；將離心機(jī)調(diào)至4000 r/min離心5 min；立即小心棄去上清液，將測(cè)試管邊緣的水珠擦干；加300 μL溫水，用旋渦振蕩混合10 s將沉淀物打碎；加3 mL閃爍液至試管中，加蓋，混勻，靜置1 min。在CharmⅡ7600分析儀的[3H］頻道進(jìn)行60 s計(jì)數(shù)，將測(cè)得結(jié)果與控制點(diǎn)比較，如果樣品cpm值大于控制點(diǎn)，則判為陰性；如果樣品cpm值小于或等于控制點(diǎn)，應(yīng)判定為初篩陽(yáng)性。

1.2.4 控制點(diǎn)的確定 首先用LC-MS方法確定6組飼料中四環(huán)素類殘留陰性樣品，選陰性樣品加標(biāo)濃度為50 μg/kg作為控制點(diǎn)。在6份陰性樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成樣品中四環(huán)素類含量50 μg/kg，用1.2.2方法進(jìn)行提取后，按照1.2.3的步驟進(jìn)行測(cè)定，得出6個(gè)cpm值，計(jì)算其平均值?？紤]提取過(guò)程中的回收以及防止假陰性出現(xiàn)，因此控制點(diǎn)的cpm值確定在平均值的基礎(chǔ)上上調(diào)15%，即控制點(diǎn)cpm 值＝平均值×（1＋15%）。

1.2.5 陽(yáng)性結(jié)果的確定 當(dāng)樣品cpm值小于控制點(diǎn)cpm值時(shí)，應(yīng)首先同時(shí)測(cè)定一個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控，測(cè)試的陽(yáng)性質(zhì)控應(yīng)該小于控制點(diǎn)，以確定試劑和設(shè)備工作正常，再重新平行取樣檢測(cè)。如果重測(cè)樣品的cpm小于控制點(diǎn)，且試劑和設(shè)備正常，則判定樣品初篩陽(yáng)性。改用LC-MS法進(jìn)行確定。

1.2.6 交叉反應(yīng) 分別將氯霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、紅霉素、螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，添加到陰性樣品中，配成含單一抗生素以及多種抗生素濃度為1000 μg/kg的飼料樣品，樣品處理及檢測(cè)方法同1.2.2和1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將金霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加入四環(huán)素陰性飼料樣品中，使飼料的金霉素添加濃度分別為 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3中測(cè)定步驟檢測(cè)其cpm值，結(jié)果見(jiàn)表1。

由于在CharmⅡ放射免疫分析中作為受體的細(xì)菌和被[3H］標(biāo)記的抗原的量是固定的，因此當(dāng)樣品中競(jìng)爭(zhēng)性抗原濃度增加時(shí)其競(jìng)爭(zhēng)效率下降，Δcpm逐漸減少。

表1 金霉素添加濃度與cpm值的關(guān)系

2.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn) 用50 μg/kg篩選水平，分別空白添加四環(huán)素、土霉素、金霉素以及它們混合標(biāo)準(zhǔn)，混標(biāo) 1：土霉素∶四環(huán)素∶金霉素=4∶3∶3，混標(biāo) 2：四環(huán)素∶土霉素∶金霉素=4∶3∶3，混標(biāo) 3：金霉素∶土霉素∶四環(huán)素=4∶3∶3。 結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 篩選水平50 μg/kg的樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性檢出率 %

從表2可以看出，無(wú)論是單標(biāo)還是混標(biāo)，在50 μg/kg篩選水平實(shí)驗(yàn)中結(jié)果均為陽(yáng)性。

2.3 比對(duì)實(shí)驗(yàn) 在對(duì)用LC-MS法檢測(cè)結(jié)束的50組留檢樣品，其中四環(huán)素類（總量大于50 μg/kg）陽(yáng)性留檢樣品10組及陰性樣品40組，用放射免疫法分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 應(yīng)用檢測(cè) 以50 μg/kg作為篩選濃度，對(duì)20組市場(chǎng)購(gòu)買的飼料進(jìn)行篩選，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 放射免疫法與LC-MS法對(duì)50組樣品分析符合情況

表4 飼料中四環(huán)素類抗生素殘留測(cè)定

用LC-MS方法驗(yàn)證5、10、18號(hào)樣品的四環(huán)素類殘留總量結(jié)果分別為 161.4、70.5、284.1 μg/kg；同時(shí)驗(yàn)證其余陰性樣品，測(cè)定結(jié)果均小于50 μg/kg。表明應(yīng)用情況良好，篩選結(jié)果可靠。

2.5 交叉反應(yīng) 經(jīng)過(guò)多次反復(fù)對(duì)1.2.6中其他族抗生素加標(biāo)試驗(yàn)，與控制點(diǎn)cpm值進(jìn)行比較，結(jié)果均為陰性。表明CharmⅡ四環(huán)素類抗生素放射免疫檢測(cè)法特異性強(qiáng)，與本族以外的抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。

3 小結(jié)

目前在日常檢測(cè)中陽(yáng)性樣品很少，因此檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)是快速區(qū)分陽(yáng)性與陰性樣品。CharmⅡ放射免疫分析法是結(jié)合微生物學(xué)與免疫學(xué)各自的特點(diǎn)發(fā)展起來(lái)的。放射免疫檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最廣泛、快速、靈敏的檢測(cè)抗生素殘留的方法，該法適用于大量樣品的篩選。飼料樣品前處理簡(jiǎn)單、干擾因素小，只需簡(jiǎn)單處理便可檢測(cè)，從接收樣品到出結(jié)果，整個(gè)過(guò)程大約20 min。陰性結(jié)果不但表明該樣品中含四環(huán)素族單種抗生素濃度分別小于50 μg/kg，同時(shí)也可表明，四環(huán)素族濃度總和不超過(guò)50 μg/kg。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一種很好的飼料中多種四環(huán)素類藥物檢測(cè)的快速篩選方法。

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