超聲波降解法對(duì)殼聚糖結(jié)構(gòu)的影響研究

李軍立，張波，馬力*

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都，610039）

1 引言

甲殼素是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1.4糖苷鍵形式連接而成的多糖，殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的N-脫乙酰產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)單元是氨基葡萄糖的二糖，一般而言，N-乙酰基脫去55%以上的就可稱之為殼聚糖，是自然界中唯一的天然陽(yáng)離子高聚物[1]，是天然存在的唯一堿性多糖，也被譽(yù)為第六大生命要素[2,3], 其pKa值為6.3[4,7]，這種脫乙酰度的殼聚糖能溶于1%的乙酸或者1%的鹽酸。

低分子量(黏均分子量小于5×104)殼聚糖不僅具有一些與殼聚糖相似的性質(zhì)，而且比高分子量殼聚糖有著更為廣泛的應(yīng)用，還具有其特殊的生理生化活性，因此，便出現(xiàn)了各種各樣的有關(guān)殼聚糖的降解的方法，但這些方法或多或少的對(duì)殼聚糖的結(jié)構(gòu)有著一定的影響，而殼聚糖的特殊的生理生化活性與其特殊的分子結(jié)構(gòu)是密不可分的，因此，考究一種方法是否科學(xué)可行，是否對(duì)殼聚糖結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞，是評(píng)價(jià)這種方法優(yōu)劣的重要手段，為此，本論文在前人研究的基礎(chǔ)上，來(lái)探討超聲波降解法對(duì)殼聚糖結(jié)構(gòu)的影響，并驗(yàn)證這種方法科學(xué)可行性。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)來(lái)研究超聲功率對(duì)殼聚糖結(jié)構(gòu)的影響，并利用紅外光譜法找出最適的超聲波功率范圍。

2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖(D.D.84.24%、分子量為97013)

濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司

溴化鉀(分析純)

成都市邛崍宏旺化工貿(mào)易有限公司

其他所用藥品均為分析純

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)

寧波新芝科器研究所

Heto Lyolab3000冷凍干燥機(jī)

安徽省尚馬科工貿(mào)有限公司

傅立葉紅外光譜儀

天津市拓普儀器有限公司

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 原料的預(yù)處理

首先，稱取20g的原料殼聚糖加入1000mL預(yù)先制備好的1%的鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌至殼聚糖充分溶解后，抽濾，除去不溶解的殼聚糖和雜質(zhì)，收取濾液，再向?yàn)V液中加入1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9，使得所溶解的殼聚糖充分沉淀，低速離心5min后，棄上清液，回收沉淀，用去離子水反復(fù)沖洗沉淀直至pH值為中性，離心分離，重復(fù)3～5次后，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥后，密封保存。

2.3.1.2 殼聚糖脫乙酰度測(cè)定[8]

準(zhǔn)確稱取0.3～0.5g 殼聚糖樣品，置于250 mL燒杯中，加入足量的 0.1mol/L HCl 溶液(30mL)，在20～30℃用磁力攪拌器攪拌2～3 h 至完全溶解，加5至6滴指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol /L NaOH 溶液滴定,至溶液變成淺藍(lán)綠色。另稱取一份樣品，于105℃烘干至恒重，測(cè)水分。每個(gè)樣品各做三次。通過(guò)測(cè)定氨基含量，便可以測(cè)的殼聚糖的脫乙酰度(D.D.)。

① NH2/%=[(C1V1-C2V2)×0.016/G(100-W)]×100

②脫乙酰度(D.D.)/%=(NH2%/9.94%)×100

式中，C1——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mo1/L)；

C2——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mo1/)；

V1——加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；

V2——滴定消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；

G——樣品的質(zhì)量(g)；

W——樣品中含有的水分(%)；

0.016 ——與1mL的1mol/L鹽酸溶液相當(dāng)?shù)陌被?g)

2.3.1.3 殼聚糖分子量測(cè)定[9]

本實(shí)驗(yàn)采用烏氏粘度計(jì)法測(cè)定殼聚糖的分子量，根據(jù)下面公式[η]=KMνa可計(jì)算出原料殼聚糖的黏均分子量Mν。其中[η]為樣品黏度；K、a為系數(shù)，根據(jù)脫乙酰度選定相關(guān)數(shù)值。

2.3.1.4 殼聚糖的超聲波降解

準(zhǔn)確稱取1g精制后的殼聚糖溶解于100 mL1%鹽酸溶液中，直至完全溶解，共配制5份，然后分別在超聲功率為350W、400W、450W、500W、550W作用下，將殼聚糖溶液間歇式超聲處理120min(僅計(jì)超聲時(shí)間)后，超聲降解期間，溫度控制在40℃左右。超聲完成后快速將每份的降解產(chǎn)物在45℃減壓濃縮1h，然后分別對(duì)每份用1mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為9，收集沉淀，用丙酮反復(fù)洗滌至中性，冷凍真空干燥，利用烏氏黏度計(jì)測(cè)定每份溶液黏度，即可獲得不同的低聚分子量殼聚糖M1、M2、M3、M4、M5。

2.3.1.5 紅外光譜檢測(cè)

采用溴化鉀壓片法對(duì)降解后的殼聚糖M1、M2、M3、M4、M5的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)降解前后殼聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化進(jìn)行探討。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 殼聚糖脫乙酰度測(cè)定結(jié)果

① NH2/%=[(C1V1-C2V2)×0.016/G(100-W)]×100

②脫乙酰度(D.D.)/%=(NH2%/9.94%)×100

C1——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mo1/L)；本實(shí)驗(yàn)C1=0.0998 mo1/L

C2——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mo1/L)；本實(shí)驗(yàn)C2=0.103mo1/L

V1——加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；本實(shí)驗(yàn)V1=30mL

V2——滴定消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；本實(shí)驗(yàn)平均消耗V2=7.5mL

G——樣品的質(zhì)量(g)；本實(shí)驗(yàn)G=0.5g

W——樣品中含有的水分(%)；本實(shí)驗(yàn)W=15.0799%

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定NH2%=8.37%；D.D.%=84.24%

2.4.2 殼聚糖分子量測(cè)定結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)測(cè)定可知，殼聚糖黏度[η]=87.27mL·g-1，通過(guò)查閱資料可得K=1.424×10-3mol/g，a=0.96，代入公式[η]=KMνa便可以得到原料殼聚糖的黏均分子量97013。

2.4.3 殼聚糖超聲波降解結(jié)果與分析

5份殼聚糖試樣在降解溫度、超聲時(shí)間、溶液濃度一定，超聲功率不同的條件下，降解后每份溶液黏度、分子量與功率的關(guān)系如表2.1。

表2.1 超聲功率與降解后溶液黏度和分子量的關(guān)系

2.4.4 降解產(chǎn)物的紅外光譜與分析

按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定原料殼聚糖經(jīng)過(guò)不同功率超聲波降解后，各分子量大小的殼聚糖的紅外光譜圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

(1) 原料殼聚糖的紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

按照按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定降解后殼聚糖的紅外譜圖見(jiàn)圖2.1。

由圖2.1可知，在3402.52cm-1左右的寬峰是O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰，并對(duì)應(yīng)于殘?zhí)腔系牧u基和氨基，并且這個(gè)峰的寬窄可以反映出分子內(nèi)和分子間氫鍵的強(qiáng)弱程度，在2919 cm-1～2880 cm-1之間分別對(duì)應(yīng)著殘?zhí)腔系募谆虼渭谆腃─H伸縮振動(dòng)吸收峰，圖2.2中并不是很明顯。原料殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶在1651.80 cm-1左右，為α-殼聚糖，β-殼聚糖為1631cm-1左右[10]，此吸收峰的強(qiáng)弱可以判斷殼聚糖的晶型，并反映的乙酰氨基[11]，該峰的強(qiáng)弱與脫乙酰度有直接關(guān)系。原料殼聚糖的酰胺Ⅱ譜帶在1557 cm-1左右，該吸收峰在各文獻(xiàn)中的報(bào)道差異較大，有時(shí)相差50cm-1左右[12]，脫乙酰度的高低決定了殼聚糖分子中酰胺基團(tuán)參與分子內(nèi)和分子間的氫鍵的數(shù)目和種類不同，因此該吸收峰的強(qiáng)弱也反映了脫乙酰度的高低。該殼聚糖的酰胺Ⅲ譜帶在1400cm-1左右，由圖2.1可知，殼聚糖的C─H彎曲和─CH3對(duì)稱變形振動(dòng)吸收峰為1398cm-1。C6─OH是一級(jí)羥基，在1091.39cm-1有特征吸收峰，而C3─OH是二級(jí)羥基，在1120cm-1有特征吸收峰，這兩個(gè)特征吸收峰用于檢測(cè)甲殼素或者殼聚糖的衍生化反應(yīng)，用處很大，只要測(cè)出這兩個(gè)峰的峰面積或峰高就可以知道反應(yīng)是發(fā)生在一級(jí)羥基上還是在二級(jí)羥基上。

(2) 350W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定降解后殼聚糖的紅外譜圖見(jiàn)圖2.2。

由圖2.2可知，O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現(xiàn)在3402.80cm-1左右，與原料殼聚糖相比，無(wú)顯著變化，并且殘?zhí)腔系募谆虼渭谆腃─H伸縮振動(dòng)吸收峰也無(wú)顯著變化。殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶在1651.79 cm-1左右，與原料極為接近，說(shuō)明殼聚糖的晶型未發(fā)生改變，脫乙酰度未發(fā)生較大改變。殼聚糖的酰胺Ⅲ譜帶在1389.10 cm-1左右與原料殼聚糖接近，并且一級(jí)羥基和二級(jí)羥基均與原料殼聚糖接近，因此，在超聲功率為350W下超聲兩小時(shí)，除了分子量降低外并未對(duì)殼聚糖的結(jié)構(gòu)造成顯著影響。

(3) 400W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定降解后殼聚糖的紅外譜圖見(jiàn)圖2.3。

由圖2.3可知，在400W超聲波下降解兩小時(shí)后的殼聚糖的結(jié)構(gòu)與原料殼聚糖的結(jié)構(gòu)相比，未發(fā)生顯著變化，降解后的殼聚糖的O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰均在3042 cm-1左右，說(shuō)明殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用并未發(fā)生顯著變化。

(4) 450W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定降解后殼聚糖的紅外譜圖見(jiàn)圖2.4。

由圖2.4可知，O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現(xiàn)在3438.14 cm-1左右，可能是因?yàn)闅ぞ厶欠肿觾?nèi)和分子間氫鍵作用的改變所致，同樣一級(jí)羥基C6─OH也發(fā)生較小位移，總的來(lái)說(shuō)，超聲功率為450W的超聲波，對(duì)殼聚糖降解后的結(jié)構(gòu)影響不顯著。

(5) 500W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

原料殼聚糖在超聲功率為500W的超聲波下作用兩小時(shí)后的紅外光譜結(jié)果如下：

由圖2.5可知，降解后的殼聚糖的O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現(xiàn)在3424.43cm-1左右，與原料殼聚糖的吸收峰接出現(xiàn)位置相比發(fā)生位移，說(shuō)明了殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用有所改變，殼聚糖的C─H彎曲和─CH3對(duì)稱變形振動(dòng)吸收峰也發(fā)生較小的位移，總的來(lái)說(shuō)殼聚糖的基本結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著性變化。

(6) 550W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測(cè)結(jié)果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測(cè)定降解后殼聚糖的紅外譜圖見(jiàn)圖2.6。

由圖2.6可知，殼聚糖的O─H的伸縮振動(dòng)吸收峰與N─H的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成的多重吸收峰的峰寬較原料殼聚糖的峰寬變窄，原因是殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵被削弱所致，并且降解后殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶吸收峰出現(xiàn)在1634.28 cm-1左右，較原料殼聚糖發(fā)生較嚴(yán)重的偏移，可能是因?yàn)闅ぞ厶堑囊阴０被堪l(fā)生了較大變化，此外，還在3585.53 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰，原因是樣品中含有微量的結(jié)晶水或游離水所致?？偟膩?lái)說(shuō)，550W的超聲波對(duì)殼聚糖降解后結(jié)構(gòu)的影響較顯著。

3 結(jié)論

通過(guò)超聲波降解殼聚糖的研究結(jié)果表明，隨著超聲功率的增加，降解后殼聚糖的結(jié)構(gòu)的影響也逐漸增加，為了保證降解后殼聚糖的結(jié)構(gòu)不發(fā)生顯著變化，并結(jié)合其他原因，所采用的超聲波超聲功率不宜超過(guò)550W，并可以得到質(zhì)量?jī)?yōu)良的低聚殼聚糖。

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