反相高效液相色譜法測定虎杖根中白藜蘆醇及其苷的含量

鄒盛勤

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000）

虎杖( polygonum cuspidatum siobet Zucc.) 為蓼科屬多年生草本植物的根或根莖，在我國大部分地區(qū)廣泛分布?；⒄刃晕段⒑⒖啵瑲w肝、膽、肺經(jīng)，具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對虎杖的化學(xué)成分、藥理作用、提取分離做了許多研究，發(fā)現(xiàn)其根莖含有多羥基芪類化合物白藜蘆醇及其苷，屬于單寧質(zhì)多酚[1]，對人體具有降血脂、抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈硬化、增強(qiáng)免疫功能等重要調(diào)節(jié)作用，是一種極具開發(fā)價(jià)值的天然物質(zhì)[2]。據(jù)調(diào)查，目前市場上的藥材主要來源于江西、貴州、四川、江蘇、浙江等地區(qū)，主要含有蒽醌類化合物、白藜蘆醇及苷、水溶性多糖和鞣質(zhì)等成分，在臨床上廣泛應(yīng)用[3,4]。本文建立了同時(shí)測定不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇的定量方法，為客觀評價(jià)虎杖的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器和試藥

Waters HPLC儀(美國，515泵，2996光電二極管陣列檢測器，77251進(jìn)樣閥，Empower中文色譜數(shù)據(jù)工作站)；SK2510HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司) ；RO-MB-10D高純水機(jī)(杭州永潔達(dá)膜分離設(shè)備廠)。甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），其余試劑均為分析純，水為超純水。虎杖苷、白藜蘆醇對照品（Sigma公司）?；⒄雀勺越魇∫舜菏?，經(jīng)鑒定為蓼科植物虎杖polygonum cuspidatum的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取虎杖苷和白藜蘆醇3.58 mg和3.70 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得含虎杖苷和白藜蘆醇0.358 mg/mL和0.370 mg/mL的對照品混合溶液，備用。

2.2 樣品溶液的制備

虎杖根與80℃下烘干8 h，粉碎過20目篩。精密稱取2.0 g虎杖根粉末于50mL容量瓶中，加入50 ml甲醇，稱重。超聲提取30 min，冷卻后補(bǔ)足損失重量，搖勻后用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3 檢測波長的選擇

采用PAD檢測器在190~400 nm波長范圍內(nèi)掃描，虎杖苷在流動(dòng)相中的最大吸收波長均為216.3和319.2 nm，白藜蘆醇在流動(dòng)相中的最大吸收波長為216.3 和306.1 nm選擇319 nm為檢測波長，信噪比高，基線平穩(wěn)，待測組分峰形對稱?；⒄溶蘸桶邹继J醇在流動(dòng)相中的紫外吸收光譜見圖1

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇∶1%磷酸水溶液（50∶50），流速為0.8 mL/min，檢測波長319 nm，柱溫30℃，采用外標(biāo)法定量分析。虎杖苷和白藜蘆醇理論塔板數(shù)均大于3000，對稱因子分別為1.03、1.05。對照品及樣品色譜圖見圖2。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取對照品混合溶液10 μL，平行進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算色譜系統(tǒng)精密度，虎杖苷和白藜蘆醇峰面積RSD分別為0.42 %(n=5)和0.56 %(n=5)。進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對照品溶液分別于1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積。虎杖苷和白藜蘆醇峰面積的RSD分別為0.84%和1.14%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一虎杖根樣品5份，每份各約2.0 g，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，測定其峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算含量，虎杖苷和白藜蘆醇含量的RSD分別為1.95 %(n=5)和1.62 %（n=5）。結(jié)果表明，樣品制備方法重現(xiàn)性良好。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品混合溶液各2.0，6.0，10.0，15.0，20.0 mL進(jìn)樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(μV·s)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得虎杖苷回歸方程為：Y=3.02×105X-1.84×104（r=0.9996），線性范圍0.716~7.160 μg，LOD（檢測限）為0.92 ng，LOQ（定量限）為2.61 ng；白藜蘆醇回歸方程為：Y=3.40×105X-2.16×104（r=0.9998），線性范圍0.740~7.400 μg，LOD為0.85 ng，LOQ為2.17 ng。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的虎杖根樣品6份，每份約1.0 g，分別加入虎杖苷和白藜蘆醇對照品適量，按樣品制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測定含量，虎杖苷平均回收率為99.7 %，RSD為1.81 %（n=6）；白藜蘆醇平均回收率為98.5 %，RSD為2.02 %（n=6）。

2.9 樣品含量測定

取不同根齡虎杖根藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，準(zhǔn)確吸取20μL，進(jìn)樣分析，平行測定3次，外標(biāo)法計(jì)算各樣品中虎杖苷和白藜蘆醇的含量。樣品測定結(jié)果見表1。

表1 不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 測定結(jié)果表明，不同根齡虎杖根樣品中白藜蘆醇及其苷的含量差異較大，虎杖苷和白藜蘆醇在根齡2~3年間含量均最高，虎杖苷的含量約為白藜蘆醇的4倍。提示虎杖根的最佳采收期為根齡2~3年，期間其主要活性物質(zhì)芪類化合物及其苷總含量最高。

3.2 在樣品預(yù)處理時(shí)，保持其他提取條件不變，考察了提取次數(shù)對樣品中虎杖苷和白藜蘆醇提取率的影響。經(jīng)測定比較，第2次提取液中虎杖苷的峰面積為第1 次提取液的2.46 %，白藜蘆醇的峰面積為第1次提取液的2.22%，可認(rèn)為提取1 次后，虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇已基本提取完全。故樣品溶液的制備均采用甲醇超聲提取30 min。

3.3 本文建立了同時(shí)測定不同根齡虎杖根中的2種主要有效成分含量的反相高效液相色譜定量方法，虎杖苷和白藜蘆醇獲得基線分離，且具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于虎杖藥材的質(zhì)量控制。

[1] 潘明新,王小陽.虎杖的化學(xué)成分及其藥理作用[J].中藥材,2000,23(1):56-58.

[2] 肖凱,宣利江,徐亞明,等.虎杖的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志, 2003, 38(1): 12-15.

[3] 黃遠(yuǎn)芬,李蓓蓓,羅霄山.虎杖及其有效成分藥理作用研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué), 2000,10(6): 13-15.

[4] 楊紅美,陳波,曾建國,等.HPLC同時(shí)測定虎杖及其提取物中4種有效成分的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(3):202-205.