尿素免疫脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究*

陜西省人民醫(yī)院普外科(西安 710068) 段降龍 龍延濱 李國威

醫(yī)用尿素(Medical urea)是非手術(shù)治療血管瘤的常用藥物之一,尿素可使血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生皺縮、變性、壞死,進(jìn)而纖維化,從而達(dá)到治療血管瘤的目的[1]。但是臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)尿素治療血管瘤周期長,合并多種并發(fā)癥。為了克服這些缺點,我們研究以血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的單克隆抗體作為偶聯(lián)抗體制備尿素免疫脂質(zhì)體,并對其理化特性進(jìn)行初步研究。

材料和方法

1 主要試劑和儀器 醫(yī)用尿素(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院),膽固醇(上海生化試劑公司),注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司),Anti-human VEGF R2單克隆抗體(美國 R&D Systems公司),Coomassie蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bio-Rad公司 )。85p-72型低溫超速離心機(日本 HIT ACHI公司),BP-190S電子天平(德國賽多利司公司),RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),UV-265紫光分光光度計(日本島津公司),KQ-250超聲波發(fā)生器(江蘇昆山淀山湖檢測儀器廠),TEM-2000EX型透射電子顯微鏡(日本電子公司)。

2 方 法 ①制備尿素脂質(zhì)體:采用逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體。經(jīng)過大量預(yù)實驗和單因素考察,確定乙醚的用量,藥物濃度,磷脂和膽固醇的用量及超聲時間等,優(yōu)選出制備工藝條件。將大豆磷脂、膽固醇按重量比 4∶ 1的比例混合,溶入 5ml乙醚中,加入尿素 2.4g和蒸餾水 5ml,在超聲波發(fā)生器上進(jìn)行 10min超聲,直至形成穩(wěn)定的 W/O型乳劑。在 25℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā),除去乙醚。達(dá)到膠態(tài)后,滴加蒸餾水 5ml水化。依次過 0.8 μ m,0.45 μ m的微孔濾膜。最后在減壓下繼續(xù)蒸發(fā),制得尿素脂質(zhì)體,即濃度為 24%的尿素脂質(zhì)體 10ml。②制備尿素免疫脂質(zhì)體:取 24%的尿素脂質(zhì)體溶液 1.0ml,加入 25%的戊二醛 25 μ l,于20℃放置 10min,過量戊二醛通過生理鹽水透析除去,透析時間 2h。中間換 1次液,加入 0.5mg VEGFR2(flk-1/KDR)單克隆抗體,4℃過夜,即制得 24%的尿素免疫脂質(zhì)體。經(jīng) 60Co滅菌后 4℃貯存。③尿素免疫脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)特征觀察:取尿素免疫脂質(zhì)體原液、稀釋10倍液、稀釋 100倍液各 1滴,分別滴于 Formwan膜銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸負(fù)染,靜置放干燥。透射電鏡觀察尿素免疫脂質(zhì)體的形態(tài)特征。④包封率的測定:取尿素脂質(zhì)體 0.5ml,將其加至 Sephadex-50柱頂端,然后自頂端滴入去離子水,分別收集滴出液至試管中,每支試管收集 3ml滴出液。滴出液流速為 1ml/min,室溫下層析。5ml比色管中分別依次加入試管滴出液,PDAB顯色劑,放置 10min后在分光度計上,于 440nm處測定吸光度值,以不含尿素脂質(zhì)體的試劑溶液作參比。⑤偶聯(lián)率的測定:通過密度梯度離心法將免疫脂質(zhì)體分離,分別測定分離液中脂質(zhì)體和蛋白含量。同時含有脂質(zhì)體和蛋白的分離液中蛋白含量即為偶聯(lián)上的VEGFR2單克隆抗體量。

結(jié) 果

1 尿素免疫脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)特征 尿素免疫脂質(zhì)體肉眼觀為乳白色混懸液,放置不易產(chǎn)生沉淀,儲存 6個月劑型外觀無明顯變化。透射電鏡觀察尿素免疫脂質(zhì)體稀釋 10倍液較原液易觀察,可見散在分布的尿素免疫脂質(zhì)體(圖 1),分布均勻,但有大量的尿素免疫脂質(zhì)體重疊,難以觀察。尿素免疫脂質(zhì)體稀釋 100倍液在透射電鏡下可見到典型的尿素免疫脂質(zhì)體形態(tài)(圖2)。尿素免疫脂質(zhì)體多為大單層脂質(zhì)體,呈球形或近球形,直經(jīng)約 150～200nm,可見到“類核仁”結(jié)構(gòu),尿素免疫脂質(zhì)體形成的包膜結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)雙分子膜規(guī)整。

圖1 尿素免疫脂質(zhì)體鏡下形態(tài)(透射電鏡,×25000)

圖2 尿素免疫脂質(zhì)體鏡下形態(tài)(透射電鏡,×40000)

2 脂質(zhì)體包封率測定結(jié)果 依據(jù)葡聚糖凝膠柱工作原理及各試管尿素含量測定結(jié)果,繪制尿素脂質(zhì)體洗脫曲線(圖 3)。從洗脫曲線可以看出尿素含量呈雙峰曲線,第一個峰曲線為脂質(zhì)體包封尿素的含量,約為 410 μ g,第二個峰曲線為脂質(zhì)體未包封的游離尿素含量 ,約為 344 μ g,總尿素含量為 754 μ g,尿素柱回收率達(dá) 97.73～ 96.79%。按照中國藥典 2000年版的脂質(zhì)體包封率計算公式計算尿素脂質(zhì)體包封率,即包封率=(W總-W游)/W總×100%,W總為總藥物量,W游為未包入脂質(zhì)體的游離藥物量。尿素脂質(zhì)體包封率=脂質(zhì)體包封尿素含量 /總尿素含量×100%=410/754× 100%=54.4%。

圖3 尿素脂質(zhì)體洗脫曲線

3 脂質(zhì)體偶聯(lián)率測定結(jié)果 由各層提取液蛋白含量測定值得出偶聯(lián)上的 VEGFR2單克隆抗體量約為 184.2 μ g/ml。 依據(jù)偶聯(lián)率計算公式(偶聯(lián)率=偶聯(lián)上的蛋白質(zhì)量 /起始蛋白質(zhì)量×100%)計算出尿素免疫脂質(zhì)體偶聯(lián)率約為 36.84%。

討 論

尿素亦稱羰基二氨,分子量為 60.60。結(jié)晶的尿素呈粉狀雪白色固體,可溶于蒸餾水、生理鹽水及 0.25～2%的普魯卡因溶液中,水溶液呈中性(pH7.2～ 7.3)。臨床應(yīng)用顯示尿素治療血管瘤療效肯定。但是由于尿素治療血管瘤缺乏靶向治療作用,尿素注入血管瘤體后,在血流的作用下,逐漸分散,難于在瘤體內(nèi)形成高濃度聚集,往往需多次注射治療,使治療周期延長,增加患兒痛苦;并且由于尿素濃度過高,單位時間內(nèi)用藥量過大,尿素局部注射可引起皮膚組織壞死,局部潰破,感染等并發(fā)癥;同時亦可造成鄰近正常組織器官的血運障礙,引起發(fā)育畸形。為了減少尿素治療血管瘤的并發(fā)癥,縮短治療周期,我們研究用脂質(zhì)體包裹尿素,以保護(hù)尿素,延緩其生物降解,尿素從脂質(zhì)體中緩慢釋放,藥效持續(xù)時間長;同時通過細(xì)胞內(nèi)吞和融合作用,脂質(zhì)體直接將尿素送入細(xì)胞內(nèi),避免使用高濃度游離尿素,減少尿素用量,降低尿素治療血管瘤后并發(fā)癥的發(fā)生。脂質(zhì)體是由雙分子層組成,內(nèi)部為水相的囊泡結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)類似生物膜。脂質(zhì)體作為藥物載體是當(dāng)前極受重視也是最有前途的藥物靶向系統(tǒng)[2]。脂質(zhì)體本身無特異靶向性,可在偶聯(lián)劑的作用下,將特異性抗體或受體連接到脂質(zhì)體表面,得到專一性作用于靶細(xì)胞的免疫脂質(zhì)體,從而大大提高了藥物的作用。

VEGFR2是一個非常重要的血管生成調(diào)節(jié)物,為跨膜受體,其與血管瘤的發(fā)生和發(fā)展有非常密切的關(guān)系[3];本研究將 V EGFR2的單克隆抗體作為尿素免疫脂質(zhì)體的偶聯(lián)抗體,采用交聯(lián)法中戊二醛法,即用戊二醛作為偶聯(lián)劑,使其兩端的醛基分別與磷脂的-NH2和抗體的-NH2縮合,從而將己制備好的尿素脂質(zhì)體與VEGFR2的單抗隆抗體偶聯(lián),制得尿素免疫脂質(zhì)體。包封率是指包封在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量占加入藥物的百分比,是評價脂質(zhì)體質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[4]。本研究采用葡聚糖凝膠柱層析法分離尿素脂質(zhì)體和游離尿素。將測得的總尿素含量和游離尿素含量代入包封率計算公式,得到脂質(zhì)體包封率約為 54.4%。影響脂質(zhì)體包封率的因素很多,如藥物-類脂比,藥物的性質(zhì)以及制備方法等[5]。在其它條件相同情況下,脂質(zhì)體中藥物的包封率最主要的由藥物本身性質(zhì)所決定的。一般情況下,脂溶性藥物比水溶性藥物更易于包封,分子量大藥物可以獲得較高的包封率。本研究中,脂質(zhì)體包裹的藥物-醫(yī)用尿素 ,為水溶性藥物,呈中性,分子量較小,約60.60,故與脂溶性藥物相比,脂質(zhì)體包封率偏低。當(dāng)處方組成相同,使用不同的制備方法,可以得到不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體,逆相蒸發(fā)法、熔融法得到的脂質(zhì)體包封率較高,有文獻(xiàn)報道脂質(zhì)體包裹水溶性藥物的包封率多小于 45%[6]。本研究采用逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體,制得的脂質(zhì)體為大單室脂質(zhì)體,故脂質(zhì)體的包封率較其他文獻(xiàn)高,粒徑適宜,結(jié)果滿意。類脂的組成也是影響包封率的主要原因之一,對于水溶性藥物來講,適當(dāng)提高磷脂-膽固醇中膽固醇的量,可以增加脂質(zhì)體中水相的體積,從而提高藥物的包封率[7]。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)磷脂和膽固醇的重量比例為 4∶1時,尿素脂質(zhì)體包封率最高。

藥物-類脂的比例亦影響脂質(zhì)體的包封率。一般提高類脂的比例可以提高包封率,因為類脂成分的增加有助于形成更多的脂質(zhì)囊泡,以提供更多的包裹空間,有利于藥物與脂質(zhì)的相互作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)藥脂之比為 1∶60時,尿素脂質(zhì)體的包封率較高。油水比亦影響尿素脂質(zhì)體的包封率。油水比小時,不能很好地形成穩(wěn)定的油包水型乳液,油水比過高,則脂質(zhì)體中包入的水溶性藥物絕對量太少[9]。本研究發(fā)現(xiàn)尿素脂質(zhì)體的油水比為 5∶1時,包封率較高。

水相介質(zhì)的不同對包封率也有較大影響。有研究者報道[10]以蒸餾水、0.9%氯化鈉和 5%甘露醇溶液為水相制得的阿昔洛韋脂質(zhì)體,包封率分別為 65%、46%和 55%,提示蒸餾水作為水相介質(zhì)包封率較高。本研究發(fā)現(xiàn) 10ml的蒸餾水已能提供足夠的水相空間容納加入的注射用尿素,如果再增加水的量反而易造成藥物的滲漏,使包封率下降。

偶聯(lián)率是反映免疫脂質(zhì)體質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。影響偶聯(lián)率的因素很多,包括偶聯(lián)方法、偶聯(lián)抗體的類型,脂質(zhì)體制備方法等。有研究者報道[11]隨著抗體質(zhì)量濃度的增加,抗體交聯(lián)脂質(zhì)體的蛋白質(zhì)量先增加后降低,提示抗體質(zhì)量濃度具有飽和性;應(yīng)用交聯(lián)法制備免疫脂質(zhì)體的關(guān)鍵是控制偶聯(lián)劑的濃度、磷脂比例和偶聯(lián)時間。本研究檢測尿素免疫脂質(zhì)體的偶聯(lián)率為36.84%。若能對抗體進(jìn)行預(yù)處理,篩選反應(yīng)條件,設(shè)置最佳反應(yīng)溫度和時間,抗體和脂質(zhì)體最佳配比,尿素免疫脂質(zhì)體的偶聯(lián)率可望進(jìn)一步提高。

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