• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TNF-α對(duì)銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的影響

    2011-04-27 11:11:02武警陜西總隊(duì)醫(yī)院西安710054程隨濤張衍國(guó)呂雅潔張惠中余春艷
    陜西醫(yī)學(xué)雜志 2011年6期
    關(guān)鍵詞:角質(zhì)纖維細(xì)胞銀屑病

    武警陜西總隊(duì)醫(yī)院(西安 710054) 徐 皓 程隨濤 張衍國(guó) 呂雅潔 張惠中 余春艷

    銀屑病是一種表皮過(guò)度增殖為特征的慢性皮膚病,發(fā)病機(jī)理尚不明確,近年來(lái)研究表明銀屑病皮損中成纖維細(xì)胞存在異常,認(rèn)為成纖維細(xì)胞可能是銀屑病發(fā)病的重要因素之一。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種炎癥因子,在銀屑病的發(fā)病中具有重要作用,我們采用 GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片研究以 TNF-α為刺激條件下,尋常型銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化情況,為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用提供相應(yīng)的理論支持。

    材料與方法

    1 材 料 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,DMEM、PBS購(gòu)自 GIBCO公司,硫酸鏈霉素、氨芐青霉素購(gòu)自華北制藥股份公司,TRIZOL購(gòu)自INVIT ROGEN公 司,TNF-α購(gòu) 自 ABD公司。GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片為Affymetrix公司產(chǎn)品。

    2 方 法 ①成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。利用小鼠抗型膠原一抗進(jìn)行細(xì)胞鑒定。②TNF-α對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞基因表達(dá)影響的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組加入 TNF-α15ng/ml,72h培養(yǎng),空白對(duì)照組未加。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液基。加入 Tizol,按照Trizol總 RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取總 RNA,用電泳及分光光度計(jì)測(cè) A260/A280鑒定 mRN A質(zhì)量。 RNA定量,反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA并進(jìn)行純化。用Bio Array High Yield RNA Transcrip tLableling體轉(zhuǎn)錄合成生物素化 cRNA。cRNA片斷化,與Affymetrix133芯片雜交、染色、洗滌。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用 Microarray SuitVersion 5.0和 Data Mining Tool Version 2.0獲取芯片雜交信息,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。采用 Genmapp和 Mappfinder進(jìn)行功能聚類和途徑分析,該軟件中的數(shù)據(jù)庫(kù)(生物途徑圖)來(lái)源于 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),并與 Gene Ontology(GO)Consortium鏈接,在 Genmapp運(yùn)行結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)在分析生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行聚類分析,并進(jìn)行顯著相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。

    結(jié) 果

    1 雜交與掃描結(jié)果 將基因芯片與制備的探針雜交后,掃描 Cy3與 Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值,用專用軟件分析,差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為基因表達(dá)變化在 2倍以上者為陽(yáng)性。根據(jù) GO分類與 GENE M APP分類,差異表達(dá)基因共有 730條,其中上調(diào)基因 395條,下調(diào) 335條。

    2 散點(diǎn)圖分析 分別以參加比對(duì)兩組數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值(Ln)作為橫縱坐標(biāo)作圖,沿 45度對(duì)角線方向分布的基因,表示它在兩樣本中的表達(dá)量是相同的。距離對(duì)角線垂直距離越遠(yuǎn)的基因,表示它在某一樣本中的差異表達(dá)程度越大。設(shè) R=S/C(S代表縱坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù),C代表橫坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù))。

    3 功能聚類分析 對(duì)差異顯著基因,即變化倍數(shù)在 2倍及 2倍以上的基因進(jìn)行 Mappfinder功能聚類分析。具體分布情況見(jiàn)表 1。

    4 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學(xué)過(guò)程 見(jiàn)表2。

    討 論

    基因芯片的特點(diǎn)是大規(guī)模、高通量和高平行性地研究成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)情況,廣泛應(yīng)用于基因功能的研究[2]。銀屑病是一種以表皮過(guò)度增殖為特征的慢性皮膚病,病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚?,F(xiàn)研究表明銀屑病患者成纖維細(xì)胞可維持銀屑病皮損表皮的高增殖狀態(tài),產(chǎn)生較高水平的 IL-6、IL-8[3]、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子[4]。故認(rèn)為銀屑病成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌釋放高水平的細(xì)胞因子可能是造成角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖的重要始動(dòng)因素[5]。 TNF-α在銀屑病的發(fā)病中具有重要的作用。為了研究成纖維細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用,我們用基因芯片分析了在 TNF-α作用下,銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果表明在TNF-α單一因素的作用下,銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生了重大變化,有 730條基因表達(dá)有明顯變化,涉及合成、分解、加工、修飾、運(yùn)輸、調(diào)控、細(xì)胞周期和凋亡等多個(gè)生物過(guò)程。在這些基因中,還有近 1/3的基因功能未知。提示在 TNF-α的刺激下成纖維細(xì)胞可能通過(guò)合成和分泌多種因子,造成細(xì)胞周圍環(huán)境的多因素變化,從而引起角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖。其中涉及免疫的基因有 31條,在以往銀屑病研究中已有相關(guān)報(bào)道有 IL-15、 C3和 PLA2G4C,未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道有IL-32、CD163、CD83、PTX3、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白 (GBP1)等。IL-15在銀屑病皮損整個(gè)表皮以及直接與表皮基底細(xì)胞接觸的真皮細(xì)胞高表達(dá),而在正常皮膚中只有表皮下部的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)[6]。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下 IL-15的基因表達(dá)明顯升高,說(shuō)明銀屑病患者皮損中的 IL-15不僅僅是來(lái)源于免疫系統(tǒng),真皮內(nèi)的成纖維細(xì)胞可能是皮損中 IL-15的重要來(lái)源,這與以往研究相符合,同時(shí)也證明我們?cè)囼?yàn)的可靠性與結(jié)果的可信性。C3在補(bǔ)體系統(tǒng)中主要參與旁路激活途徑,表現(xiàn)為感染早期的非特異性免疫,其水解片段具有多種生物活性,如過(guò)敏毒素作用、中性粒細(xì)胞的趨化作用,增強(qiáng)炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生等。C3對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用,中性粒細(xì)胞釋放的溶酶體激活補(bǔ)體,形成中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用惡性環(huán)路,促使銀屑病反復(fù)發(fā)作及慢性化。

    表1 按照 GO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物學(xué)活性過(guò)程分類

    表2 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學(xué)過(guò)程

    PLA2G4C磷脂酶 A2(PLA2)是一類催化磷脂二位酰基水解的酶族,是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介質(zhì)生成的限速酶,促進(jìn)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放和激活,直接影響炎性病變的發(fā)展和預(yù)后。雖然沒(méi)有直接證據(jù)證明 PLA2與銀屑病發(fā)病相關(guān),但是體外試驗(yàn)表明 PLA2通過(guò)酶解產(chǎn)物花生四烯酸,誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞殖[7]。因此 PLA2可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)。

    IL-32是先天免疫中的關(guān)鍵效應(yīng)器。具有趨化外周血單核細(xì)胞作用。 IL-32 α通過(guò)活化 NF-κ B和 p38 MAPK的磷酸化誘導(dǎo)多種炎癥因子包括 TNF-α的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下,釋放 IL-32,IL-32誘導(dǎo)產(chǎn)生 TNF-α,放大TNF-α的效應(yīng),參與了銀屑病 TNF-α惡性循環(huán)的形成。CD163血色素-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物的受體,通過(guò)調(diào)節(jié)血紅素氧合酶-1的表達(dá),參與抗炎、抗氧化作用。CD163具有單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞特異性,在炎癥組織或血液循環(huán)的單核細(xì)胞中,CD163的表達(dá)增高。IL-6,IL-10和糖皮質(zhì)激素促使 CD163表達(dá)上調(diào),而干擾素和TNF-α使其表達(dá)下調(diào)[8]。本試驗(yàn)表明 CD163可能不僅僅表達(dá)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上,也表達(dá)在成纖維細(xì)胞上,在 TNF-α刺激下成纖維細(xì)胞的 CD163基因表達(dá)不是降低,而是明顯增高。這與以往的研究結(jié)果不符,是否由于銀屑病患者的成纖維細(xì)胞功能紊亂造成,還需進(jìn)一步深入研究。

    CD83是細(xì)胞表面Ⅰ型膜糖蛋白。不僅僅是成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的標(biāo)志,還是 DC發(fā)揮其激發(fā)免疫應(yīng)答作用中不可缺少的功能分子。分為膜結(jié)合型和可溶型,膜結(jié)合型 CD83增強(qiáng) T細(xì)胞應(yīng)答,促進(jìn)免疫反應(yīng)的作用??扇苄?CD83具有強(qiáng)大的免疫反應(yīng)抑制作用,抑制DC的成熟和 T細(xì)胞的增殖[9]。 PTX3結(jié)合蛋白相關(guān)基因,是 TNF誘導(dǎo)表達(dá)基因之一。作為炎癥急性期反應(yīng)蛋白,PTX3特異性結(jié)合在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核膜上,能夠提高血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì) TNF的敏感性,提高細(xì)胞合成 TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞因子。GBP1鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GBP1),簡(jiǎn)稱 G蛋白。 由α、β和γ三個(gè)亞單位組成,α亞單位上有鳥(niǎo)苷酸結(jié)合位點(diǎn)。主要在激素受體結(jié)合的部分與腺苷環(huán)化酶之間起調(diào)節(jié)作用。當(dāng) G蛋白上結(jié)合的鳥(niǎo)苷酸為 GT P時(shí)則激活而發(fā)揮作用,但當(dāng) G蛋白上的 GTP水解為 GDPA時(shí)則失去活性。當(dāng)激素與受體結(jié)合時(shí),活化的受體與 G蛋白的α亞單位結(jié)合,促使其與β、γ亞單位脫離,通過(guò)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶起激活或抑制作用,從而實(shí)現(xiàn)激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能的調(diào)節(jié)。

    試驗(yàn)中銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下,不僅僅是激活免疫的細(xì)胞因子基因表達(dá)增高,而且抑制免疫的細(xì)胞因子基因表達(dá)也升高。此外還涉及到炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡等多方面原因,其病理變化不是一種細(xì)胞因子造成的,而是多種細(xì)胞因子共同改變的結(jié)果,許多基因其生物學(xué)過(guò)程與功能并不是十分清楚。越來(lái)越多的研究表明 TNF-α與銀屑病關(guān)系密切。說(shuō)明銀屑病患者皮膚成纖維細(xì)胞可能合成免疫相關(guān)細(xì)胞因子的功能失衡,在銀屑病的發(fā)病中具有重要的意義。這些免疫相關(guān)的基因與銀屑病的發(fā)病關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

    [1] 李海紅.人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)雜志,2005,17(2):89.

    [2] Dasu M R,Hawkins HK,Barrow RE,et al.Gene expressi on profiles from hypertrophic scar fibroblasts before and after IL-6stimulation[J].J Pathol,2004,202:476~ 485.

    [3] Zalewska A,Glowacka E,Wyczolkowska J,et al.Sysa-Jedrzejowska,Interleukin 6 and 8 levels in plasma and fibroblast cultures in psoriasis[J].Mediators Inflamm,2006,81:767.

    [4] Kovacs D,Falchi M,Cardinali G,et al.Immunohistoche mical analysis of keratinocyte growth factor and fibroblast growth factor10 expression in psoriasis[J].Exp Dermatol,2005,(14):130-137.

    [5] 趙小東,付 萌,盧 濤,等.銀屑病成纖維細(xì)胞培育上清對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響 [J].中華現(xiàn)代皮膚科學(xué)雜志,2004,1(2):34-35.

    [6] 張國(guó)龍,張學(xué)軍,張勝權(quán),等.IL-15在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá) [J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,(04):34-35.

    [7] Sjursen W,Brekke OL,Johansen B.Secretory and cytos olic phospholipase A(2)regulate the long-term cytokineinduced eicosanoid production in human keratinocytes[J].Cytokine,2000,(12):1189-1194.

    [8] Weaver LK,Pioli PA,Wardwell K,et al.Up-regulation of human monocyte CD163 upon activation of cell-surface Toll-like receptors[J].J Leukoc Biol,2007,(18):663-671.

    [9] Fujimoto Y,Tu L,Miller AS,et al.CD83expression influences CD4+T cell development in the thymus[J].Cell,2002,108:755-767.

    猜你喜歡
    角質(zhì)纖維細(xì)胞銀屑病
    Tiger17促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移
    滇南小耳豬膽道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定
    尋常型銀屑病治驗(yàn)1則
    紫外線A輻射對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷作用
    骨角質(zhì)文物保護(hù)研究進(jìn)展
    胃癌組織中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4的表達(dá)及臨床意義
    尋常型銀屑病合并手指Bowen病一例
    兩種制備大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的方法比較
    角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    鈣泊三醇倍他米松軟膏在銀屑病治療中的應(yīng)用
    国产亚洲精品久久久久久毛片| 日本成人三级电影网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费观看的影片在线观看| 中国美女看黄片| 国产精品 国内视频| 国产精品 国内视频| a在线观看视频网站| 久久九九热精品免费| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久久色成人| 久9热在线精品视频| 久久久久国内视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 丰满乱子伦码专区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日本免费a在线| 成人午夜高清在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 国模一区二区三区四区视频| 99精品久久久久人妻精品| e午夜精品久久久久久久| 日本黄色片子视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利18| 99国产极品粉嫩在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品电影一区二区在线| 亚洲自拍偷在线| 国产免费av片在线观看野外av| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久亚洲真实| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲国产色片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 桃色一区二区三区在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美午夜高清在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久久久久久黄片| 色综合站精品国产| 久久6这里有精品| 日本一二三区视频观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 人人妻人人看人人澡| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品一区av在线观看| www.色视频.com| 淫秽高清视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲人与动物交配视频| 天堂影院成人在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 黄色日韩在线| 精品人妻1区二区| 久久久成人免费电影| 91麻豆精品激情在线观看国产| 丰满乱子伦码专区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美色视频一区免费| 一级黄片播放器| 亚洲在线观看片| 亚洲欧美日韩东京热| 动漫黄色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 俄罗斯特黄特色一大片| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美一级毛片孕妇| 国产色爽女视频免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美日韩黄片免| 精品久久久久久,| 国产91精品成人一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 欧美激情在线99| 成人性生交大片免费视频hd| 美女高潮的动态| 99热这里只有是精品50| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲美女黄片视频| 国产精品免费一区二区三区在线| or卡值多少钱| 久久6这里有精品| 免费观看人在逋| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲精品久久久com| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美乱色亚洲激情| 两个人的视频大全免费| 欧美在线黄色| 99精品欧美一区二区三区四区| 日日干狠狠操夜夜爽| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一本综合久久免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av天堂在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲成人久久爱视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线观看一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久久国内视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲电影在线观看av| 国产欧美日韩一区二区三| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜视频国产福利| 亚洲av五月六月丁香网| 大型黄色视频在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 国产成人福利小说| 欧美黑人巨大hd| 国产69精品久久久久777片| 国产色婷婷99| 免费无遮挡裸体视频| 日本五十路高清| 色吧在线观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 美女被艹到高潮喷水动态| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 天天添夜夜摸| 色综合站精品国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中国美女看黄片| 日本黄色片子视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲午夜理论影院| 成年女人看的毛片在线观看| www日本黄色视频网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 桃红色精品国产亚洲av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线播放国产精品三级| 香蕉久久夜色| 免费在线观看影片大全网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产一区二区在线av高清观看| 最近最新免费中文字幕在线| 在线观看日韩欧美| 高清在线国产一区| 91九色精品人成在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 成年女人永久免费观看视频| 欧美黑人巨大hd| 成年免费大片在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 无限看片的www在线观看| 91久久精品电影网| 一级a爱片免费观看的视频| 国产一区二区激情短视频| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 首页视频小说图片口味搜索| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 性色avwww在线观看| 国产美女午夜福利| 老司机午夜福利在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 老汉色∧v一级毛片| 变态另类丝袜制服| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品,欧美在线| 国产精品精品国产色婷婷| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看舔阴道视频| 不卡一级毛片| 久久99热这里只有精品18| 国产三级黄色录像| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品在线美女| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲成av人片免费观看| 99久久综合精品五月天人人| 免费av观看视频| h日本视频在线播放| 成人三级黄色视频| 国产精品久久久久久精品电影| 天堂√8在线中文| 日日干狠狠操夜夜爽| 一级黄片播放器| 国产探花在线观看一区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 嫩草影视91久久| 欧美午夜高清在线| 成人午夜高清在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 看片在线看免费视频| 身体一侧抽搐| 国产精品av视频在线免费观看| 色综合站精品国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 99热这里只有精品一区| netflix在线观看网站| 日韩欧美 国产精品| 国产黄a三级三级三级人| 黄片大片在线免费观看| 日本在线视频免费播放| 无限看片的www在线观看| 精品人妻1区二区| 有码 亚洲区| 国模一区二区三区四区视频| 黄色丝袜av网址大全| h日本视频在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 嫩草影院精品99| 久99久视频精品免费| 亚洲在线自拍视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲美女视频黄频| 深夜精品福利| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲午夜理论影院| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 级片在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 99久久综合精品五月天人人| 免费看光身美女| 美女免费视频网站| 亚洲无线在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 九色国产91popny在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 女人被狂操c到高潮| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美一区二区亚洲| 久久久国产成人精品二区| 91在线观看av| 最好的美女福利视频网| 免费大片18禁| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产高清三级在线| av专区在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品无人区乱码1区二区| 欧美日本视频| 日本与韩国留学比较| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 中出人妻视频一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 99久久精品热视频| 观看美女的网站| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 身体一侧抽搐| 叶爱在线成人免费视频播放| 校园春色视频在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲激情在线av| 午夜福利视频1000在线观看| 国产色婷婷99| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av熟女| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 一级作爱视频免费观看| 午夜视频国产福利| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品一区二区三区av网在线观看| 我的老师免费观看完整版| 免费大片18禁| 校园春色视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 97超视频在线观看视频| tocl精华| 国产熟女xx| 国产精品久久久人人做人人爽| tocl精华| 亚洲国产欧美网| 少妇丰满av| 日本一二三区视频观看| 丁香六月欧美| 国产男靠女视频免费网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 天堂影院成人在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品久久久久久久久免 | 在线播放国产精品三级| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 女人被狂操c到高潮| 精品福利观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 三级毛片av免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丰满的人妻完整版| 一区二区三区免费毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 大型黄色视频在线免费观看| 我要搜黄色片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产欧美人成| www国产在线视频色| 又紧又爽又黄一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 美女 人体艺术 gogo| 日韩欧美在线乱码| 人人妻人人澡欧美一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 三级毛片av免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久这里只有精品中国| 午夜老司机福利剧场| 天堂网av新在线| 在线视频色国产色| 国产精品 国内视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 黄色日韩在线| 99在线人妻在线中文字幕| 国产日本99.免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 操出白浆在线播放| 激情在线观看视频在线高清| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利高清视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产成人av激情在线播放| 最好的美女福利视频网| 亚洲人成电影免费在线| 激情在线观看视频在线高清| 久久久国产精品麻豆| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品电影一区二区在线| 一区二区三区免费毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人一区二区视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 久久亚洲真实| 久久久久久久久中文| 热99在线观看视频| 99热6这里只有精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区在线av高清观看| 男女那种视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产97色在线日韩免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 最近最新免费中文字幕在线| 91在线观看av| 一二三四社区在线视频社区8| av黄色大香蕉| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线免费观看的www视频| aaaaa片日本免费| 在线a可以看的网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久人妻av系列| 婷婷精品国产亚洲av在线| 黄片大片在线免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品99久久久久久久久| 国产精品,欧美在线| 国产单亲对白刺激| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品日韩av在线免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 精品久久久久久,| 熟女人妻精品中文字幕| av天堂中文字幕网| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产在视频线在精品| 欧美av亚洲av综合av国产av| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品不卡国产一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产亚洲精品av在线| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人欧美在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美最黄视频在线播放免费| 在线观看一区二区三区| 国产成人av教育| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 麻豆国产97在线/欧美| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 窝窝影院91人妻| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久国产成人免费| 日韩精品中文字幕看吧| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲第一电影网av| 精品人妻1区二区| a在线观看视频网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久久久久午夜电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 中文字幕高清在线视频| 久久中文看片网| 日韩欧美在线二视频| 国产精品影院久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级黄色大片毛片| 欧美日韩乱码在线| av专区在线播放| 黄片小视频在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产野战对白在线观看| 久久久国产成人免费| 国产老妇女一区| 搡老妇女老女人老熟妇| 9191精品国产免费久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 最新美女视频免费是黄的| 午夜免费观看网址| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| av女优亚洲男人天堂| 动漫黄色视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天天添夜夜摸| 久久精品国产综合久久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产乱人视频| 日韩亚洲欧美综合| 中文亚洲av片在线观看爽| 最近最新免费中文字幕在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 制服丝袜大香蕉在线| 成人精品一区二区免费| 九色成人免费人妻av| 国产成人av激情在线播放| 免费电影在线观看免费观看| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产99白浆流出| 欧美激情在线99| 国产探花极品一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99精品在免费线老司机午夜| 97超视频在线观看视频| 成人18禁在线播放| 久久这里只有精品中国| 91麻豆av在线| 搡老岳熟女国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 我的老师免费观看完整版| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久精品91蜜桃| 久久久久九九精品影院| 黄色日韩在线| 老鸭窝网址在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 日日干狠狠操夜夜爽| 天天一区二区日本电影三级| а√天堂www在线а√下载| 国产免费男女视频| 天美传媒精品一区二区| 一个人看视频在线观看www免费 | 香蕉久久夜色| 天天添夜夜摸| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 无限看片的www在线观看| 国产在视频线在精品| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产探花极品一区二区| 一个人免费在线观看电影| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩精品中文字幕看吧| 日韩av在线大香蕉| 免费无遮挡裸体视频| 色播亚洲综合网| 一级黄色大片毛片| 国产成人影院久久av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品1区2区在线观看.| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| а√天堂www在线а√下载| 婷婷亚洲欧美| 18美女黄网站色大片免费观看| 小说图片视频综合网站| 午夜福利在线观看吧| 欧美区成人在线视频| 免费观看的影片在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 久99久视频精品免费| 91字幕亚洲| 两人在一起打扑克的视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 99在线人妻在线中文字幕| 99热这里只有是精品50| 深夜精品福利| 免费在线观看日本一区| 亚洲av电影在线进入| 国产精品99久久久久久久久| 一夜夜www| av天堂中文字幕网| 午夜福利视频1000在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲人与动物交配视频| 国产男靠女视频免费网站| 久久久国产成人精品二区| 五月伊人婷婷丁香| 日本在线视频免费播放| 色吧在线观看| 成人欧美大片| 亚洲av电影在线进入| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久久末码| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 99国产极品粉嫩在线观看| 女人被狂操c到高潮| av国产免费在线观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品电影一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 91在线观看av| 69av精品久久久久久| 午夜两性在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 男人舔奶头视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 草草在线视频免费看| 国产精品 欧美亚洲| 男女床上黄色一级片免费看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产黄色小视频在线观看| h日本视频在线播放| 国产成人影院久久av| 国产爱豆传媒在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久精品91蜜桃| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本三级黄在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久6这里有精品| 动漫黄色视频在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长|