EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究△

第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(西安 710032)

鐵 茹 胡 浩 谷仲平* 曲 萍 于 軍 陳寶瑩*▲

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快、對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,而非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是其中最常見(jiàn)的組織學(xué)類型[1,2]。早期轉(zhuǎn)移是 NSCLC引起死亡的最常見(jiàn)原因,在此過(guò)程中受體型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)發(fā)揮重要的作用[3,4]。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞激酶(Erythropoietin-producing hepatocyte kinase,EPH)受體組成 RTK家族最大的亞家族,到目前為止,已在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有 16個(gè)成員[5,6]。 EPH受體是和 ephrin的配體相互作用,EPH受體分為兩類:EPHA(包括 EPHA1～ 10)和 EPHB(包括 EPHB1～ 6),這兩類受體分別與各自的配體結(jié)合發(fā)揮作用。EPH受體與其配體結(jié)合之后產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng),包括細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞遷移[7,8]。EPHB6作為 EPHB受體之一,它的表達(dá)失活與人類多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[9,10]。 Matsuoka等[11]發(fā)現(xiàn)EPHB6在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移過(guò)程中具有正反兩方面的作用。因此,對(duì) EPHB6在細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用還存在爭(zhēng)議。我們?cè)隗w外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中研究了 EPHB6對(duì) NSCLC轉(zhuǎn)移的作用。與正常肺組織相比,A549 NSCLC細(xì)胞系低水平表達(dá) EPHB6[12],為此,我們選擇A549細(xì)胞作為主要模型研究 EPHB6的作用。

材料和方法

1 材 料 Dulbecco's Modified Eagle's培養(yǎng)基(DMEM,Invitrogen,USA);10%的胎牛血清(FCS);2mmol/L-谷氨酸 ;100ml青霉素、 100 μ g/ml鏈霉素;濾膜 (8 μ m孔徑,Corning Inc.,Corning,NY,USA);ERK(1∶ 1000稀 釋,Cell Signaling Technology,USA);兔抗人 EPHB6(1 μ g/ml,Santa Cruz,USA);小 鼠抗 人 β-actin(40ng/ml,sigma,USA);非肥胖糖尿病 /嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)。

2 方 法 為了闡明 EPHB6在肺癌細(xì)胞中的作用,我們建立了能夠穩(wěn)定表達(dá) EPHB6的 A549細(xì)胞系(A549-EPHB6)和不表達(dá) EPHB6的對(duì)照組細(xì)胞系(A549-PCDNA4)。 ①細(xì)胞培養(yǎng):A549 HTB58肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)采用改良 Dulbecco's Modified Eagle's培養(yǎng)基,輔以 10%的胎牛血清(FCS),2mmol/L-谷氨酸,100ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素 ,于 37℃、 5%二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)。② Western blotting:用冰凍的 PBS沖洗細(xì)胞,加入含 150mmol NaCl的冰冷 RIPA緩沖液,冰上裂解 30min。20000g、4℃ 離心 10min內(nèi)清除細(xì)胞裂解物。調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后,在 SDS上樣緩沖液中95℃加熱細(xì)胞裂解物 10min,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE,4%,Invitrogen)以分離蛋白,之后轉(zhuǎn)到PVDF膜。蛋白檢測(cè):一抗,兔抗人 EPHB6,兔抗人磷酸化或總 ERK,小鼠抗人β-actin。采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)二抗,化學(xué)發(fā)光法 (ECL Plus,Amersham Pharmacia,Sweden)顯色。③黏附實(shí)驗(yàn):24孔板表面預(yù)先包埋部分所示濃度的 EPHB6配體Ephrin-B2-Fc,Ephrin-B2-Fc溶解于含有 5mg/ml牛血清蛋白的 PBS中,4℃過(guò)夜。室溫下,用含 20mg/ml BSA的 PBS封閉 60min,隨后棄去封閉液,用不含F(xiàn)CS的 M EN培養(yǎng)基清洗,以每孔 2×105的密度接種細(xì)胞于含有 10% FCS的 MEN培養(yǎng)基中,37℃黏附30min后進(jìn)行分析,洗掉沒(méi)有黏附的細(xì)胞,拍照并采用流式細(xì)胞儀對(duì)黏附在粘附 24孔板表面的細(xì)胞計(jì)數(shù)。④細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):用 50 μ g/ml纖維連接蛋白、5mg/ml BSA的 PBS包被細(xì)胞轉(zhuǎn)移小室的濾膜,室溫下放置60min,棄封閉液后用不含 FCS-的 MEM培養(yǎng)基清洗濾膜。在 100 μ l帶有 1% FCS的 MEM中,總數(shù)為 5×105的細(xì)胞被接種于上層小室,下層小室加入含有10% FCS的 400 μ l M EM,37℃放置 24h,遷移至下小室的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。⑤在體腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):非肥胖糖尿病 /嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)雌鼠飼養(yǎng) 8～9周后,在注射前 24h用 3.5Gy輻射處理,20只小鼠隨機(jī)分成兩組,1組為對(duì)照組、1組為 EPHB6實(shí)驗(yàn)組,每組 10只。一組尾靜脈注射 A549-EPHB6細(xì)胞,另一組注射 A549對(duì)照組細(xì)胞。平均每只小鼠注射劑量是 1.5×106細(xì)胞,小鼠在注射 4周后處死。取肺組織之后冷凍于液氮中,或用 4%甲醛固定,石蠟包埋后進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以個(gè)體資料樣本和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用 SPSS(15.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。多組間兩均數(shù)比較采用方差分析,兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t-檢驗(yàn),配對(duì)樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t-檢驗(yàn),腫瘤轉(zhuǎn)移率的比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)系數(shù)采用雙尾Spearman檢驗(yàn)計(jì)算。 P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體外實(shí)驗(yàn) 將 A549-EPHB6細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞置于用不同濃度 Ephrin-B2-Fc包被的細(xì)胞培養(yǎng)上,如圖 1A、圖 1B所示,A549-EPHB6細(xì)胞顯示出對(duì)Ephrin-B2-Fc包被平板較高的黏附性,并呈劑量依賴性,在 Ephrin-B2-Fc達(dá)到 4μ g/ml時(shí)其黏附能力達(dá)到峰值。黏附能力的升高有可能導(dǎo)致遷移能力的降低,而遷移實(shí)驗(yàn)恰恰證實(shí) EPHB6的重表達(dá)使細(xì)胞遷移率降低 80%(如圖 2A;P＜0.001)。由于所有肺癌細(xì)胞系都低水平表達(dá) EPHB6,因此我們用 siRNA技術(shù)抑制A549-EPHB6細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在 si RNA干擾 EPHB6表達(dá)后,細(xì)胞的遷移水平顯著升高(如圖 2B,P＜0.05)。將 EPHB6基因轉(zhuǎn)染進(jìn) HTB58細(xì)胞中(另一種低表達(dá) EPHB6的 NSCLC細(xì)胞系)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移水平降低 30%(如圖 2D,P＜0.05),表明 EPHB6對(duì)細(xì)胞遷移的作用不局限于 A549細(xì)胞。

圖1 體外實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 體外實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 體外實(shí)驗(yàn)表明 EPHB6能夠降低A549肺癌細(xì)胞的遷移能力,提示 EPHB6可能對(duì)腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移具有抑制作用。因此,我們將表達(dá) EPHB6的 A549細(xì)胞和不表達(dá) EPHB6的 A549細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射入兩組(每組 10只)小鼠體內(nèi),四周之后在對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn) 67%的實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)生了轉(zhuǎn)移,而對(duì)照組小鼠只有 10%發(fā)生轉(zhuǎn)移(如圖 3A;P＜0.05),并且實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生轉(zhuǎn)移的小鼠只有一個(gè)轉(zhuǎn)移灶,而對(duì)照組小鼠則出現(xiàn)多發(fā)的轉(zhuǎn)移灶,而在其他器官如皮膚、腎、腦等處沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移(如圖 3B～ D)。

圖3 在體腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn),EPHB6能夠直接抑制體外NSCLC細(xì)胞遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。所得結(jié)果提示 EPHB6是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。最近的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道了 EPHB6對(duì)人類浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞的作用[13]。我們的在體實(shí)驗(yàn)表明 EPHB6的表達(dá)水平直接影響到 NSCLC細(xì)胞的功能,如遷移能力。因此,EPHB6介導(dǎo)的信號(hào)通路很可能有直接抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用,但是其具體的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

EPHB6是一種“假激酶”,因?yàn)槠浼っ复呋Y(jié)構(gòu)域有部分的保守氨基酸發(fā)生改變,導(dǎo)致其無(wú)催化活性[14]。EPHB6作為標(biāo)記,與許多腫瘤的預(yù)后密切相關(guān),這可能與其特異性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性有關(guān),而與它固有的激酶活性無(wú)關(guān)。盡管 EPHB6有激酶結(jié)構(gòu)域的缺陷,但是有文獻(xiàn)報(bào)道 EPHB6能夠被其上游的 Src家族激酶磷酸化[15]。我們近期研究了在肺腺癌中 EPHB6的表達(dá)對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK)活化的作用[16]。但是隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制 ERK并沒(méi)有改變表達(dá) EPHB6的 NSCLC細(xì)胞的遷移能力。表明 EPHB6抑制NSCLC轉(zhuǎn)移的作用不是通過(guò)激活 ERK實(shí)現(xiàn)的。另外有報(bào)道顯示,與大腦、肺、腎等組織相比,EPHB6在胸腺中表達(dá)水平最高,且與 T-細(xì)胞的成熟成一定的正相關(guān)性[10]。 EPHB6缺失的小鼠會(huì)導(dǎo)致 T-細(xì)胞功能下降[17]。但是免疫因素對(duì) EPHB6抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用是否有影響還不清楚,值得進(jìn)一步探討。

綜上所述,EPHB6作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因可以重新激活 EPHB6和其他抑癌基因,可為預(yù)防 NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移提供新的方法。

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