新抗原基因MLAA-34在急性單核細(xì)胞白血病患者的表達(dá)及意義

趙建強(qiáng)， 張王剛， 何愛(ài)麗， 張文娟， 古流芳 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 西安 710004)

急性單核細(xì)胞白血病(AML-M5)是急性髓性白血病中較常見(jiàn)的類(lèi)型，臨床特征突出表現(xiàn)為髓外病變、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)、完全緩解率低、無(wú)病存活時(shí)間短。1998年歐洲11q23異常協(xié)作組(11q23 EUW)報(bào)道，約80%11q23異常AML患者為M4/M5亞型，證實(shí)11q23異常與單核細(xì)胞分化密切相關(guān)［1］。雖然11q23異常與M5明顯相關(guān)，但11q23異常在M5中的發(fā)生率僅6% －8%，且迄今已報(bào)道MLL基因受累的11q23染色體易位有75種，克隆到MLL基因的伙伴基因39個(gè)［2］;這些結(jié)果提示檢測(cè)發(fā)生重排的MLL基因只適用于極少數(shù)的M5患者。迄今為止對(duì)急性單核細(xì)胞白血病(M5)尚未找到其他確定的特異分子標(biāo)記物。為篩選和鑒定出急性單核細(xì)胞白血病表達(dá)率高、特異性強(qiáng)的白血病相關(guān)抗原，我們成功構(gòu)建了M5的cDNA表達(dá)文庫(kù)，通過(guò)SEREX法篩選出35條與AML-M5抗原相關(guān)的基因［3］。應(yīng)用高通量ELISA(crELISA)技術(shù)對(duì)這些抗原新基因進(jìn)行抗體特異性表達(dá)的小樣本檢測(cè)，鑒定出具有特異性抗體、陽(yáng)性率高的M5抗原新基因MLAA-34［3］，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個(gè)新的剪接變體［4］;應(yīng)用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細(xì)胞白血病發(fā)生相關(guān)的新的抗凋亡分子［4］。

MLAA-34在急性髓細(xì)胞白血病尤其在AML-M5的表達(dá)模式迄今還不是十分明確，本研究旨在構(gòu)建敏感而且可靠的熒光定量 RT-PCR方法，檢測(cè)MLAA-34基因在AML-M5患者中表達(dá)水平的變化，分析其與AML-M5化療緩解、復(fù)發(fā)及預(yù)后的關(guān)系，探討其在臨床的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2008－01～2010－01間在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科收治的初診的患者，AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓細(xì)胞白血病患者40例，經(jīng)臨床、骨髓形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)染色及免疫分型檢查確診，部分病例還進(jìn)行了染色體核型分析。男性43例，女性32例;年齡18－71歲，中位年齡46歲。同時(shí)期非惡性血液系統(tǒng)疾病患者骨髓標(biāo)本12例，健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)自本院健康教職工和學(xué)生共10例作為正常對(duì)照。來(lái)自本院血液科實(shí)驗(yàn)室冷凍保存的人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937作為陽(yáng)性對(duì)照。骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞收集后－80℃留存?zhèn)溆茫腥藛T均獲知情同意并簽署書(shū)面同意書(shū)。

1.2 誘導(dǎo)治療方案、療效的判定及療效的觀察

AML-M3由于其不同于其他亞型AML的特殊發(fā)病機(jī)制采用全反式維甲酸和/或砷劑的標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)治療［5］。除 AML-M3之外的低危 AML化療方案:MAE(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷)、HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷);高危AML化療方案:MAED(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷+地塞米松)、MMED(米托蒽醌+甲氨蝶呤+依托泊苷+地塞米松)。誘導(dǎo)緩解治療及第一個(gè)化療療程不足的患者，視為放棄治療;誘導(dǎo)緩解治療完成及第一個(gè)化療療程后觀察療效及緩解率，納入統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。療效觀察按照張之南等的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［6］，分為完全緩解(CR)，部分緩解(PR)和未緩解(NR)三組。隨訪(fǎng)時(shí)間為180 d。白血病復(fù)發(fā)的診斷指標(biāo)是:骨髓白血病細(xì)胞＞5%，但＜20%，經(jīng)有效的抗白血病治療一個(gè)療程仍未達(dá)CR者;骨髓白血病細(xì)胞＞20%;或臨床出現(xiàn)髓外白血病浸潤(rùn)(骨髓及血象仍正常)三項(xiàng)之一。

1.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque)購(gòu)自上海試劑二廠(chǎng);Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step RNA PCR Kit購(gòu)自大連Takara公司;pMD18-T載體購(gòu)自Promega Biotech公司。

1.4 方法 應(yīng)用 RT-PCR方法對(duì) AML-M5、非 M5的AML、非白血病的其他血液疾病患者及正常對(duì)照的MLAA-34 mRNA的表達(dá)水平分別進(jìn)行檢測(cè)并加以比較。對(duì)AML-M5患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解或未緩解及復(fù)發(fā))的MLAA-34 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并分析。同時(shí)對(duì)部分AML-M5患者的MLAA-34 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

1.4.1 骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離、RNA提取 EDTA抗凝的骨髓液2－3 ml或外周血5 ml在離心管中加入等量的淋巴細(xì)胞分離液，1 200 r/min離心20 min后，小心提取中間云霧狀白色單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌2次;如紅細(xì)胞及血小板較多，可加入紅細(xì)胞裂解液1 ml充分混勻后離心;Trizol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量及濃度。

1.4.2 cDNA的合成 按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄體系 20 μl包括總 RNA 1 μg，Oligo(dT)引物 50 μmol/L，RNA 酶抑制劑 20 U，5 ×MMLV緩沖液2 μl，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U。70℃10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min冰上冷卻終止反應(yīng)。

1.4.3 PCR引物及探針 目的基因 MLAA-34、管家基因β-actin引物根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)，并經(jīng)過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLAST程序驗(yàn)證其特異性，MLAA-34基因的引物、探針及陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均由廣東中山大學(xué)達(dá)安基因公司設(shè)計(jì)并合成。管家基因β-actin的引物及探針由Takara公司合成。MLAA-34引物序列:上游為5'－AAG CCG GAG AAC CTG AAA CTC －3'，下游為5'－TGA GGA CTG GCC ACA AAC AC－3'，探針序列為5'－FAM －TGA TGA ACC TCC TTC GGG ATA AAA GTATAMRA－3';β-actin引物序列:上游為 5'－TCC TTC CTG GGT ATG GAATC －3'，下游為 5'－GCA CTG TGT TGG CAT AGA GG －3'，探針序列為5'－FAM－CGG ATG TCA ACG TCA CAC TTC ATGATAMRA －3'。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 建立陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品:以高表達(dá)MLAA-34的人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937為對(duì)象，提取其總RNA、反轉(zhuǎn)錄、PCR特異性擴(kuò)增MLAA-34、β-actin基因片段，連接入pMD18-T載體，測(cè)序，構(gòu)建含有MLAA-34、β-actin基因片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，擴(kuò)增，確定其拷貝數(shù)濃度;多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR條件的優(yōu)化:對(duì)MLAA-34、βactin引物進(jìn)行 5×106，10×106，20×106pmol/L 3種不同濃度的測(cè)試，以確定在實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x上進(jìn)行反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)效果;設(shè)定探針濃度為50，100，200 nmol/L，以?xún)?yōu)化反應(yīng)條件，并選擇能產(chǎn)生最高信號(hào)強(qiáng)度且無(wú)非特異性擴(kuò)增的最適探針濃度;構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):將經(jīng)測(cè)序證明為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e稀釋成拷貝數(shù)為 104，105，106，107，108，109/μl，構(gòu)建 MLAA-34、β-actin 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并確定模板數(shù)的最佳線(xiàn)性范圍，已使模板在上述拷貝數(shù)范圍之間，與相應(yīng)的Ct值具有良好的相關(guān)性;MLAA-34的PCR反應(yīng)體系:5×定量 Buffer 10 μl，上下游引物、探針各 1 μl，dNTP、Taq 酶各 1 μl，cDNA 5 μl，加雙蒸水 30 μl使反應(yīng)總體系為 50 μl。反應(yīng)條件為:93℃ 2 min，然后93℃ 30 s，55℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，任選4－5個(gè)陽(yáng)性模板標(biāo)準(zhǔn)梯度點(diǎn)分析，若相關(guān)系數(shù)r＞0.97，表明線(xiàn)性關(guān)系良好，可確定為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出樣本熒光定量反應(yīng)的絕對(duì)定量值，定量的單位按拷貝數(shù)/μl cDNA計(jì)算。每份標(biāo)本均進(jìn)行復(fù)管檢測(cè)，取其均值作為MLAA-34的表達(dá)水平。β-actin基因的RTPCR體系及反應(yīng)條件同MLAA-34，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(M)描述，采用Kruskal Wallis test及Mann-Whitney test檢驗(yàn)分析各組間差異，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組間MLAA-34 mRNA表達(dá)比較 結(jié)果顯示，MLAA-34在AML-M5組表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組、非惡性血液疾病組及非AML-M5組的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 不同組別MLAA-34 MRNA的表達(dá)水平Tab 1 Expression of MLAA-34 MRNA in different groups

2.2 MLAA-34 mRNA在AML-M5患者不同病程階段的表達(dá) 如表2所示，初治AML-M5患者M(jìn)LAA-34 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。AML-M5復(fù)發(fā)患者M(jìn)LAA-34 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，略高于AMLM5初治組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。初治AML-M5患者經(jīng)誘導(dǎo)化療獲得完全緩解(CR)的患者M(jìn)LAA-34 mRNA表達(dá)水平較治療前明顯下降(P＜0.05)，但仍高于正常對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 MLAA-34 mRNA在AML-M5的表達(dá)水平Tab 2 Expression level of MLAA-34 mRNA in AML-M5 patients

2.3 MLAA-34基因表達(dá)與誘導(dǎo)治療療效的關(guān)系初治75例AML患者中，12例未能完成首療程治療或放棄治療，余63例(AML-M5 30例，non-M5 33例)患者化療一個(gè)療程后完全緩解42例，完全緩解率為65.8%。完全緩解(CR)組與部分緩解(PR)及未緩解(NR)組MLAA-34表達(dá)水平分別為1.86×10－3和6.32 ×102，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 MLAA-34基因mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果 對(duì)13例AML-M5患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，初診AML-M5時(shí)MLAA-34呈高度表達(dá)者，CR后MLAA-34表達(dá)水平可下降1個(gè)數(shù)量級(jí)以上，未達(dá)到緩解的患者其MLAA-34表達(dá)水平下降不顯著，維持在較高的水平。在復(fù)發(fā)的8例M5患者中，5例患者初診化療前MLAA-34表達(dá)水平較高，化療后達(dá)完全緩解后MLAA-34表達(dá)水平顯著下降，CR后180 d內(nèi)血象及骨髓象提示復(fù)發(fā)，檢測(cè)其MLAA-34表達(dá)水平也再次上升(圖1A);而其余3例M5患者初診時(shí)MLAA-34表達(dá)水平較高，CR后迅速或緩慢下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，臨床復(fù)發(fā)前90 d，血象及骨髓象復(fù)查處于緩解期，而MLAA-34表達(dá)水平卻具有上升趨勢(shì)，之后才出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)(圖1B)。

圖1 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MLAA-34基因mRNA表達(dá)水平Fig 1 MLAA-34 expression levels in the patients with clinical relapse

3 討論

急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)抗原新基因MLAA-34 cDNA全長(zhǎng)1 671 bp，用生物信息學(xué)方法分析，其有完整的ORF框，編碼一個(gè)含有337個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì);MLAA-34定位于13q14.2，在此基因座位上，存在一個(gè)基因鈣結(jié)合蛋白39(calcium binding protein 39-like，CAB39L)，而 CAB39L 是一個(gè)功能未知的新基因。應(yīng)用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細(xì)胞白血病發(fā)生相關(guān)的一個(gè)新的抗凋亡分子。

本研究采用特異的TaqMan探針來(lái)定量PCR，TaqMan探針與PCR引物對(duì)內(nèi)側(cè)的一段序列同源，并在5'端連接一個(gè)報(bào)告熒光(如FAM)，而在3'端連接一個(gè)淬滅熒光(如TAMRA)，當(dāng)此探針保持完整時(shí)，報(bào)告熒光釋放的熒光能被淬滅熒光所吸收，因此檢測(cè)不到報(bào)告熒光的熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增中Taq-Man探針結(jié)合于靶分子上，引物延伸過(guò)程中，由于TaqDNA聚合酶5'－3'外切核酸酶活性使得TaqMan探針被水解，報(bào)告熒光和淬滅熒光分離，從而使報(bào)告熒光信號(hào)能被檢測(cè)到，并隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加熒光信號(hào)也增加，通過(guò)構(gòu)建已知拷貝數(shù)的系列標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以達(dá)到定量未知標(biāo)本的目的。TAMRA在PCR過(guò)程中的變化很小，所以檢測(cè)過(guò)程中的熒光信號(hào)很穩(wěn)定，從而提高了檢測(cè)的重復(fù)性［7］。目前，臨床上已廣泛應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白血病標(biāo)志分子慢性粒細(xì)胞白血病(BCRABL)［8］、急性粒細(xì)胞白血病部分分化型(AML1-ETO)［9］、急性粒細(xì)胞白血病(PML-RARα)［10］、T 細(xì)胞性急性淋巴細(xì)胞白血病(HOX11)［11］等以進(jìn)行相應(yīng)類(lèi)型白血病的分子診斷、療效判斷及微小殘留病的檢測(cè)等。

對(duì)AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓細(xì)胞白血病患者40例，非惡性血液系統(tǒng)疾病患者12例和健康正常對(duì)照10例外周血單個(gè)核細(xì)胞的MLAA-34表達(dá)檢測(cè)的結(jié)果顯示，MLAA-34在初診AML-M5患者其基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，與我們先期應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料法的實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR技術(shù)對(duì)急性單核細(xì)胞白血病檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因mRNA在AML-M5型白血病細(xì)胞中是特異性高表達(dá)的結(jié)果是一致的，表明該基因在AML-M5中的表達(dá)具有較高的特異性，可代表一種白血病候選標(biāo)志，用于臨床鑒別診斷或疾病的篩查。另外，本研究通過(guò)檢測(cè)AML－M5不同階段MLAA-34基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)初診組和復(fù)發(fā)組顯著高于緩解組及正常對(duì)照組，復(fù)發(fā)組與正常對(duì)照組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明監(jiān)測(cè)MLAA-34基因變化對(duì)于了解病情、判斷預(yù)后有指導(dǎo)意義。跟蹤觀察13例M5患者，發(fā)現(xiàn)持續(xù)血液學(xué)CR患者M(jìn)LAA-34基因表達(dá)水平在正常范圍或附近波動(dòng);MLAA-34基因表達(dá)水平明顯高于正?；虺掷m(xù)增高均提示復(fù)發(fā)。雖在較低水平但在略超出正常水平波動(dòng)的患者是否以后易復(fù)發(fā)，有待進(jìn)一步觀察。MLAA-34 mRNA水平能夠很好地顯示療效并預(yù)測(cè)病情進(jìn)展:治療過(guò)程中隨著白血病細(xì)胞比例的減少，MLAA-34 mRNA的水平亦隨之下降;發(fā)生臨床復(fù)發(fā)的患者復(fù)發(fā)前MLAA-34 mRNA始終維持在正常水平以上或有逐步上升超出正常的過(guò)程。因此，MLAA-34 mRNA水平能夠反映白血病負(fù)荷，作為臨床治療決定、療效判斷的一項(xiàng)指標(biāo)。

［1］ van Dongen JJM，Macintyre EA，Gabert JA，et al.Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease:report of the BIOMED-1 concerted action:Investigation of minimal residual disease in acute leukemia［M］.Avenel，NJ，ROYAUME-UNI:Nature Publishing Group，1999.

［2］ De Braekeleer M，Morel F，Le Bris MJ，et al.The MLL gene and translocations involving chromosomal band 11q23 in acute leukemia［J］.Anticancer Res，2005，25(3B):1931 －1944.

［3］ Cheng G，Zhang WG，Cao XM，et al.Serological identification of immunogenic antigens in acute monocytic leukemia［J］.Leuk Res，2005，29(5):503 －509.

［4］ Zhang PY，Zhang WG，He AL，et al.Identification and functional characterization of the novel acute monocytic leukemia associated antigen MLAA-34［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(2):281－290.

［5］ Niu C，Yan H，Yu T，et al.Studies on treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide:remission induction，followup，and molecular monitoring in 11newly diagnosed and 47 relapsed acute promyelocytic leukemia patients［J］.Blood，1999，94(10):3315－3324.

［6］ 張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［M］.3版.北京:科學(xué)出版社，2008:219－228.

［7］ Giulietti A，Overbergh L，Valckx D，et al.An overview of realtime quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression［J］.Methods，2001，25(4):386 －401.

［8］ Schiffer CA.BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors for chronic myelogenous leukemia［J］.New Engl J Med，2007，357(3):258 －265.

［9］ Downing JR.The AML1-ETO chimaeric transcription factor in acute myeloid leukemia:biology and clinical significance［J］.Br J Haematol，1999，106(2):296 －308.

［10］ Jing Y.The PML-RARα fusion protein and targeted therapy for acute promyelocytic leukemia［J］.Leuk Lymphoma，2004，45(4):639－648.

［11］ Baak U，Gokbuget N，Orawa H，et al.Thymic adult T-cell acute lymphoblastic leukemia stratified in standard-and high-risk group by aberrant HOX11L2 expression:experience of the German multicenter ALL study group［J］.Leukemia，2008，22(6):1154 －1160.