腸易激綜合征大鼠骶髓后角中NMDAR、CGRP表達(dá)以及小膠質(zhì)細(xì)胞的變化

崔曼莉， 王景杰， 秦 明， 王旭霞， 楊 琦， 黃裕新 (第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科， 西安710038;通訊作者，E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一組以腹痛或腹部不適同時(shí)伴有排便習(xí)慣及大便性狀改變?yōu)橹饕Y狀的腸道功能性疾病。目前內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是腸易激綜合征重要的病理生理機(jī)制之一。

通過(guò)中樞致敏和由于慢性或反復(fù)的內(nèi)臟刺激引起脊髓背角神經(jīng)元的生長(zhǎng)，使中樞感覺興奮性增加，從而放大傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)量。研究表明腸道神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)(SP、VIP、CGRP、GABA、NO、Ach、NE 等)在IBS 的腸道、脊髓、丘腦中都有改變［1］。慢性內(nèi)臟痛IBS模型存在外周和中樞敏化機(jī)制［2，3］，并且其中樞敏化作用可被NMDAR 拮抗劑脊髓給藥所阻斷［4，5］。另有研究者報(bào)道了外周神經(jīng)損傷可以產(chǎn)生放大的疼痛反應(yīng)，同時(shí)激活了脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步采用N－甲基－D－天冬氨酸受體(NMDAR)拮抗劑MK801可以抑制產(chǎn)生的痛覺過(guò)敏和異常疼痛，同時(shí)也抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。提示膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)病理性痛的產(chǎn)生和維持非常必要［6］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究提示［7－9］，當(dāng)單純電針刺激足三里穴位時(shí)，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)中樞中的GFAP和OX42的表達(dá)明顯增高，提示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被顯著激活。給予膠質(zhì)細(xì)胞代謝阻斷劑丙戊茶堿(PPF)干預(yù)和等量生理鹽水對(duì)照，發(fā)現(xiàn)OX42的表達(dá)有顯著性的降低。說(shuō)明OX42表達(dá)量的多少反映出小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。

所以，研究IBS發(fā)病的神經(jīng)作用機(jī)制，對(duì)于臨床治療有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電生理學(xué)和免疫組織化學(xué)以及免疫熒光化學(xué)方法，在以旋毛蟲感染大鼠成功制作IBS大鼠模型基礎(chǔ)上，采用直腸氣囊充水造成壓力感受刺激的方法，研究直腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠腹直肌肌電的影響和因擴(kuò)張刺激造成的內(nèi)臟性疼痛導(dǎo)致IBS大鼠出現(xiàn)的骶髓后聯(lián)合核中NMDAR和CGRP表達(dá)的改變，為研究其發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑 保蟲昆明鼠種鼠(旋毛蟲系云黑龍江株)購(gòu)自河南省疾病預(yù)防控制中心，實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為雄性SD大鼠。兔抗大鼠CGRP單克隆抗體、兔抗大鼠NMDAR單克隆抗體、羊抗兔Texas red均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司;小鼠抗大鼠OX42單克隆抗體購(gòu)自于Chemical公司;驢抗小鼠FITC購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司。

1.2 IBS動(dòng)物模型制作 ①旋毛蟲幼蟲制備及傳代由河南省疾病預(yù)防控制中心提供的保蟲昆明鼠種鼠(旋毛蟲系云黑龍江株)共3只，脊髓脫臼法處死后剔除皮毛及內(nèi)臟，剔取肌肉。將肌肉剪碎置于300 ml 2.5%胃蛋白酶和0.5%鹽酸消化液中，置37℃水浴中消化12－20 h。經(jīng)篩過(guò)濾，濾液用生理鹽水反復(fù)沉淀洗滌3－5次，收集旋毛蟲幼蟲胞囊并計(jì)數(shù)。取昆明鼠20只，25 g左右，灌胃法給予0.1 ml含250－300條幼蟲的生理鹽水懸液。②感染大鼠后將傳代感染的昆明鼠以頸椎脫臼法處死收集旋毛蟲(方法同前)。③實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃法給予1 ml含4 000條幼蟲囊胞的生理鹽水懸液。被感染鼠飼養(yǎng)8周，抽檢測(cè)定感染情況，確立模型是否制作成功［10］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 選取10只建模成功大鼠隨機(jī)分為2組:IBS未刺激組和IBS結(jié)腸擴(kuò)張刺激組。另選5只正常大鼠做為正常對(duì)照組。

1.4 腹直肌肌電的測(cè)量 各實(shí)驗(yàn)組大鼠均測(cè)量腹直肌肌電。電極置于大鼠腹中線兩側(cè)、電極間距3－4 cm，采用RM6280B生物信號(hào)采集處理軟件記錄和分析腹壁肌電活動(dòng)(成都儀器廠生產(chǎn))。記錄安靜無(wú)刺激狀態(tài)下腹直肌放電幅值，維持30 s。間期休息5 min后，對(duì)IBS刺激組進(jìn)行結(jié)腸擴(kuò)張刺激。將氣囊緩慢插入大鼠直腸，進(jìn)入到結(jié)腸距離肛門35 mm處固定，記錄給予直腸刺激后腹直肌放電幅值，維持30 s。休息5 min后再應(yīng)用注射器給氣囊注入1.0 ml蒸餾水［11］。再次記錄給予腸道壓力后腹直肌放電幅值。電生理記錄儀參數(shù)設(shè)置:采集頻率40 kHz，掃描速度 200 ms/div，靈敏度 500 μV，時(shí)間常數(shù) 0.001 s，濾波頻率 3 kHz。

1.5 切片制備 測(cè)量腹直肌肌電后，將各組大鼠于戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉下，開胸經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，先以100 ml生理鹽水沖洗血液，隨后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)先快后慢灌流固定2 h，取腦組織置于300 g/L蔗糖中(4℃)直至組織沉底，冰凍切片機(jī)以延髓做冷凍連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm，切片分套。另外取正常組以及IBS未刺激組大鼠結(jié)腸做冰凍切片，片厚10 μm。

1.6 HE染色 取正常對(duì)照組以及IBS未刺激組大鼠結(jié)腸切片做常規(guī)HE染色，中性樹脂封片后于光鏡下觀察二者之間大體結(jié)構(gòu)變化。

1.7 免疫熒光化學(xué)標(biāo)記 取3套切片在0.01 mol/L PBS中漂洗后，入含 0.3%Triton X －100的 0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色:①3套切片分別入兔抗鼠CGRP單克隆抗體稀釋液(1∶500)、兔抗鼠NMDAR單克隆抗體稀釋液(1∶500)和小鼠抗OX42單克隆抗體稀釋液(1∶300)孵育24 h(室溫);②加入結(jié)合了熒光素的二抗:其中2套切片加入羊抗兔 Texas red(1∶500)單染CGRP和NMDAR，另一套切片加入驢抗小鼠FITC(1∶500)單染 OX42，避光孵育2 h(室溫)。0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片后，將各組的切片各取10張，在confocal激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image J圖像分析軟件，分析CGRP、NMDAR以及OX42的A值。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠與IBS大鼠結(jié)腸組織的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:正常大鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，腺體組織間隙僅見少許紅細(xì)胞浸潤(rùn)。IBS大鼠結(jié)腸組織切片顯示，腸腺體結(jié)構(gòu)完整，組織間隙可見少許紅細(xì)胞浸潤(rùn)，還可見少許中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，但是未見有顯著的淋巴結(jié)小結(jié)的集落形成(見圖1)。

圖1 經(jīng)旋毛蟲感染的IBS模型大鼠與正常大鼠結(jié)腸組織對(duì)比(HE染色，×200)Fig 1 Histology of colon in IBS rats and normal rats(HE，×200)

圖2 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠腹直肌肌電活動(dòng)的影響Fig 2 Effect of colon distension on the electro-activity of rectus abdominis in IBS rats

2.2 結(jié)腸擴(kuò)張刺激致IBS大鼠腹直肌肌電的變化本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和IBS未刺激組大鼠腹直肌肌電頻率的變化較為規(guī)律(見圖2)，二者間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，見表1)。而給予IBS大鼠以疼痛反應(yīng)高峰刺激(前期實(shí)驗(yàn)測(cè)定)后，IBS大鼠腹直肌肌電的頻率和波幅產(chǎn)生顯著性變化(圖2C)，與正常對(duì)照組和IBS未刺激組大鼠相比差異顯著(P ＜0.05，見表1)。

表1 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)大鼠腹直肌肌電的影響(n=5，±s)Tab 1 Electro-activity of the rectus abdominis in 3 groups(n=5，±s)

表1 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)大鼠腹直肌肌電的影響(n=5，±s)Tab 1 Electro-activity of the rectus abdominis in 3 groups(n=5，±s)

與正常對(duì)照組和IBS未刺激組比較，*P＜0.05

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2.3 結(jié)腸擴(kuò)張刺激引起 IBS大鼠骶髓后角中NMDAR、CGRP以及DCN中小膠質(zhì)細(xì)胞的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照大鼠骶髓后角中NMDAR表達(dá)處于一定水平，而IBS大鼠在未給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激情況下，其NMDAR的表達(dá)水平未見有顯著性變化，其熒光光度值未見明顯差異(P＞0.05，見表2，圖3)。在給予IBS大鼠以疼痛行為學(xué)高峰值刺激的情況下，IBS大鼠骶髓后角中NMDAR的表達(dá)顯著性升高，與正常對(duì)照組和IBS未刺激組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01或 P ＜0.05，見圖 3，表2)。另外，CGRP在IBS大鼠骶髓后角中的表達(dá)狀況與NMDAR的表達(dá)情況基本相似(見圖4，表2)。我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證，正常大鼠骶髓DCN中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況與IBS大鼠的情況相似，二者相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［10，11］。本研究顯示，在給予 IBS大鼠以結(jié)腸擴(kuò)張性刺激的情況下，其DCN中的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況與未刺激情況相比，二者熒光光度值差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見圖5，表2)。

表2 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠骶髓后角中NMDAR、CGRP、OX42表達(dá)的影響(A值，n=5，±s)Tab 2Expression of NMDAR，CGRP，OX42 in 3 groups(A value，n=5，±s)

表2 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠骶髓后角中NMDAR、CGRP、OX42表達(dá)的影響(A值，n=5，±s)Tab 2Expression of NMDAR，CGRP，OX42 in 3 groups(A value，n=5，±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與IBS未刺激組比較，#P＜0.05

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圖3 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠骶髓后角中NMDAR表達(dá)的影響(Bar=100 μm)Fig 3 Effect of colon distension on NMDAR expression in sacral dorsal horn of IBS rats(Bar=100 μm)

圖4 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠骶髓后角中CGRP表達(dá)的影響(Bar=100 μm)Fig 4 Effect of colon distension on CGRP expression in sacral dorsal horn of IBS rats(Bar=100 μm)

圖5 結(jié)腸擴(kuò)張刺激對(duì)IBS大鼠骶髓DCN中小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響(Bar=100 μm)Fig 5 Effect of colon distension on the activation of microglia cells in DCN of IBS rats(Bar=100 μm)

3 討論

腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。已知的一些因素包括腸道動(dòng)力和腸平滑肌功能障礙、精神心理異常、內(nèi)臟感覺異常、植物神經(jīng)功能紊亂、胃腸激素分泌異常、腦－腸軸學(xué)說(shuō)、應(yīng)激、腸道感染等［12］。內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是IBS重要的病理生理機(jī)制。有研究表明IBS患者對(duì)腸道氣囊擴(kuò)張的疼痛閾值降低［13］、疼痛強(qiáng)度增加(內(nèi)臟高敏感)，或?qū)е抡５哪c道功能狀態(tài)的敏感性增高(即異常性疼痛)，甚至內(nèi)臟相對(duì)應(yīng)的軀體牽涉痛的范圍擴(kuò)大。脊髓背角作為腦－腸軸的“中繼站”，是內(nèi)臟敏感性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。各種神經(jīng)纖維組成了脊髓節(jié)段性調(diào)質(zhì)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)IBS患者的傷害性屈曲反射研究表明，IBS患者脊髓存在著超興奮性［14］。有研究者研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎癥性的變化可以引起內(nèi)臟敏感性增高，并觀察到脊髓后角中NMDAR中的NMDAR1和NMDAR2/B陽(yáng)性細(xì)胞分布相同，并主要分布在后角深層和中央管背側(cè)的后聯(lián)合核(DCN)。提示它們的表達(dá)變化是結(jié)腸的炎癥性刺激通過(guò)內(nèi)臟傳入神經(jīng)傳導(dǎo)到脊髓的結(jié)果。

本研究表明，脊髓背角內(nèi)NMDAR陽(yáng)性數(shù)顯著升高，提示結(jié)腸刺激痛可以使NMDAR的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)升高。給予大鼠的結(jié)腸刺激痛能引起伴有外周與中樞敏化的長(zhǎng)期功能性內(nèi)臟超敏反應(yīng)，脊髓給予NMDAR受體拮抗劑能阻斷這種功能性慢性結(jié)直腸痛覺過(guò)敏，提示體內(nèi)NMDAR可能參與介導(dǎo)IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏。NMDA受體是由 NR1和NR2亞單元組成的離子通道蛋白，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體的一種類型，屬于離子型受體［15］。已被證明在“wind-up”現(xiàn)象(重復(fù)刺激 C纖維引起的放電增強(qiáng))與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、外周感受閾的擴(kuò)大、中樞過(guò)度興奮以及熱敏過(guò)程中發(fā)揮重大作用［16，17］。Ma 等［18］研究提示 NR2B 蛋白由背根神經(jīng)節(jié)(dorsa root ganglion，DRG)神經(jīng)元合成，其分布于傷害性初級(jí)傳入纖維中樞端，即脊髓背角Ⅰ層的突觸前膜。DRG神經(jīng)元外周突末梢接受傷害性刺激，終止在脊髓背角淺層的中樞突末梢，釋放神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸、SP、天冬氨酸)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)等，激活脊髓背角特異性傷害性感受神經(jīng)元，傳遞痛覺沖動(dòng)［19］。Petralia等［20］的研究發(fā)現(xiàn)大鼠 DRG 神經(jīng)元有 NR1的表達(dá)，Soliman等［21］也指出 70%的DRG中樞突末梢中同時(shí)存在著NR1和谷氨酸。而Ma等［18］研究發(fā)現(xiàn)，70%的C纖維和Aδ纖維傳入末梢表達(dá)NR2B，表明突觸前膜的NMDA受體以NR2B型為主。由此推測(cè)NR2B在脊髓水平痛覺信息傳遞中可能起到重要作用。在辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性和熱痛敏中，鞘內(nèi)注射NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑MK-801可以明顯減輕機(jī)械性痛敏和熱痛敏［21，22］。肌肉注射NMDA受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AP-5可以劑量依賴地減弱完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的肌肉痛覺過(guò)敏［23］。由此表明，NMDA受體的激活在痛敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要的作用。

CGRP是一種含有37個(gè)氨基酸殘基的多肽，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，特別是感覺神經(jīng)元胞體和末梢以及胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)叢，具有調(diào)節(jié)胃腸血流、胃腸分泌及運(yùn)動(dòng)功能［24］。從內(nèi)臟傳入神經(jīng)的外周末梢釋放的CGRP曾被認(rèn)為在內(nèi)臟痛覺過(guò)敏的外周機(jī)制中發(fā)揮了重要作用［25］。大腦的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常對(duì)IBS的腸道敏感性增高有重要的促進(jìn)作用［12］。研究發(fā)現(xiàn)［26］，IBS 患者腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞周圍CGRP等陽(yáng)性神經(jīng)纖維表達(dá)增強(qiáng)，而且在神經(jīng)肽周圍，肥大細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。Gschossmann等［27］發(fā)現(xiàn)，在鞘內(nèi)注射 CGRP受 體 拮 抗 劑(h-CGRP8-37)可呈劑量依賴性地減少反復(fù)擴(kuò)張結(jié)腸導(dǎo)致的內(nèi)臟痛覺過(guò)敏引起的腹部肌肉收縮的次數(shù)。脊髓蛛網(wǎng)膜下隙注射CGRP可使痛閾降低，且CGRP可通過(guò)促進(jìn)P物質(zhì)(SP)釋放而有利于痛覺的傳遞，可見CGRP與痛覺信號(hào)傳遞密切相關(guān)［28］。

另外，小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)臟痛的“啟動(dòng)”中可能占有重要地位。有研究報(bào)道了外周神經(jīng)損傷產(chǎn)生放大的疼痛反應(yīng)，同時(shí)激活了脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，給予NMDAR拮抗劑MK801可以抑制產(chǎn)生的痛覺過(guò)敏和異常疼痛，同時(shí)也抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。提示膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)病理性痛的產(chǎn)生和維持非常必要［2］。本研究發(fā)現(xiàn)給予IBS大鼠結(jié)腸擴(kuò)張刺激后，大鼠骶髓DCN中的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化顯著增高，與NMDAR以及CGRP的增高程度呈現(xiàn)相對(duì)應(yīng)上升關(guān)系，故此推測(cè)，疼痛活性物質(zhì)與小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)臟痛以及內(nèi)臟敏化反應(yīng)中可能共同參與在其中，但具體神經(jīng)機(jī)制尚未闡明。故闡明IBS疼痛神經(jīng)機(jī)制在指導(dǎo)日后IBS臨床治療具有舉足輕重的作用。

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