EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶在非小細(xì)胞肺癌中高甲基化失活

鐵 茹， 胡 浩， 谷仲平， 曲 萍， 于 軍， 陳寶瑩 (第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 西安 700;唐都醫(yī)院胸腔外科;唐都醫(yī)院放射科;通訊作者，E-mail:yujunby@fmmu.edu.cn)

肺癌是癌癥患者的常見死因，而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其中最常見的病理學(xué)類型［1，2］。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC引起死亡的最常見原因，在此過程中受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)發(fā)揮重要的作用［3，4］。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞激酶(erythropoietin-producing hepatocyte kinase，EPH)受體是RTK家族中最大的亞家族，到目前為止，已在動物中發(fā)現(xiàn)有16個(gè)EPH 成員［5，6］。EPH 受體與 ephrin配體相互作用。EPH受體分為兩類:EPHA(包括 EPHA1-10)和EPHB(包括EPHB1-6)，這兩類受體分別與各自的配體結(jié)合發(fā)揮作用。EPH受體與其配體結(jié)合之后產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞遷移［7，8］。EPHB6 作為 EPHB 受體之一，它的表達(dá)失活與人類多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)［9-15］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中，EPHB6的表達(dá)提示預(yù)后較好［9-11］。另外，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和具有轉(zhuǎn)移潛能的浸潤性乳腺癌細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)EPHB6表達(dá)下降［13-15］。與正常肺組織相比，A549 NSCLC細(xì)胞系低水平表達(dá) EPHB6［16］，為此，我們選擇A549細(xì)胞作為主要模型研究EPHB6表達(dá)失活的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 臨床材料 收集2007-08～2010-07醫(yī)院門診正常肺組織患者9例，以及診斷為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者78例，其中未發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC患者39例和發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC 39例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen公司，美國)，10%的胎牛血清(FCS)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，A549肺腺癌細(xì)胞，5-氮-2'-脫氧胞苷(Sigma，MO，USA)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，Madison，Wisconsin，USA)，限制性內(nèi)切酶 Sma Ⅰ(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，DNAzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，EZ DNA Methylation-Gold TM Kit試劑盒(Zymo research Corp.，Orange，CA，USA)，TOPO TA 克隆測序試劑盒(Invitrogen 公司)，兔抗人 EPHB6(1 μg/ml，Santa Cruz，USA)，RNA(Invit Promega，Madison，Wisconsin，USA rogen，Carlsbad，CA，USA)，ERK(1∶1 000 稀釋，Cell Signaling Technology，USA)，小鼠抗人 β-actin(40 ng/ml，sigma，USA)，化學(xué)發(fā)光法(ECL Plus，Amersham Pharmacia，Sweden)顯色。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)分為三組:正常肺組織組(正常組)、未發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC腫瘤組織組(對照組)、發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC腫瘤組織組(病例組)。

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)采用改良Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基，含10%的胎牛血清(FCS)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。1.3.2 患者標(biāo)本 主要的腫瘤標(biāo)本和正常的肺組織取自NSCLC外科手術(shù)，將標(biāo)本置于液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱，采用組織學(xué)方法檢查腫瘤標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞百分比，僅將含有70%腫瘤細(xì)胞的活體腫瘤組織用于后續(xù)的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)分析及隨后的DNA甲基化分析。為了排除個(gè)體間的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，還比較了另外24例NSCLC患者的成對的腫瘤組織和正常肺組織中EPHB6的mRNA表達(dá)水平。

1.3.3 5-氮-2'-脫氧胞苷處理 A549細(xì)胞用由1 mmol純水原液配置的100 μmol/L的5-氮-2'-脫氧胞苷處理。細(xì)胞每48 h補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)液和5-氮-2'-脫氧胞苷，生長2-6 d。

1.3.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 RIzol試劑分離總RNA，以1 μg RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定基因表達(dá)水平 為了觀察患者EPHB6的DNA甲基化水平，采用了甲基化敏感的SmaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行研究。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法對臨床Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織的 EPHB6表達(dá)水平進(jìn)行測定。用DNAzol(提取試劑)從每一個(gè)樣本中提取1 μg基因組 DNA，等分為兩份，每份0.5 μg，用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶SmaⅠ消化，或者用限制性內(nèi)切酶的緩沖液假消化作為對照。通過實(shí)時(shí)定量PCR用以下引物和探針對消化或假消化DNA進(jìn)行分析:正向引物5'-CGGGCCCCCAGGATCTC，反向引物5'-TGCCACCCGCGTCTTCTC，探針 5'-FAM-CGGCGCCGAACGGACCCG-TAMRA。探針位于甲基化敏感的SmaⅠ位點(diǎn)。甲基化水平的計(jì)算公式如下:甲基化水平 =2ΔCT，ΔCT=CTT-CTN(T:處理的SmaⅠ;N:未處理的SmaⅠ)。

1.3.6 亞硫酸氫鹽測序法檢測啟動子區(qū)域與CpG島甲基化水平 為了研究NSCLC中EPHB6基因被抑制的機(jī)制，需要測定了EPHB6啟動子的甲基化水平。選擇了1例腫瘤組織中EPHB6表達(dá)水平較正常肺組織顯著降低的NSCLC患者為研究對象，采用亞硫酸氫鹽測序法檢測EPHB6基因的啟動子和第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)。用DNAzol提取基因組DNA，然后按照說明書用亞硫酸氫鹽與EZ DNA Methylation-Gold TM Kit試劑盒處理。利用Methyl Primers Express version 1.0(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR。啟動子區(qū)域的甲基化水平的分析基于以下引物:5'-GGGTTGCGTTCGTTTTAGTC-3'(正向)和5'-CGCCGAAAATCCCTAAAATT-3'(反向)。內(nèi)含子區(qū)域的引物是5'-AGTTAGATTGGGGGTAGAGTAG-3'(正向)和5'-ATCTAACCAAACAACCACTTAA-3'(反向)。用TOPO TA克隆測序試劑盒克隆PCR產(chǎn)物。用至少9個(gè)帶有正常或腫瘤組織的EPHB6啟動子或內(nèi)含子區(qū)的克隆用于篩選和測序。

1.3.7 Western blot檢測 用冰凍的 PBS沖洗細(xì)胞，加入含150 mmol NaCl的冰冷RIPA緩沖液，冰上裂解30 min。20 000×g、4℃離心10 min內(nèi)清除細(xì)胞裂解物。調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后，在SDS上樣緩沖液中以95℃加熱細(xì)胞裂解物10 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE，4%，Invitrogen公司)以分離蛋白，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。蛋白檢測:一抗，兔抗人EPHB6，兔抗人磷酸化或總ERK，小鼠抗人β-actin。采用辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)二抗，化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中EPHB6表達(dá)缺失 EPHB6表達(dá)水平的測定的結(jié)果見圖1。與對照組相比，腫瘤組織中EPHB6 mRNA水平降低，最低者出現(xiàn)在手術(shù)治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者腫瘤組織中(P＜0.05，見圖1A)。另外24例NSCLC患者的腫瘤組織和正常肺組織患者中13例的EPHB6 mRNA表達(dá)水平降低(圖1B)。另外，Western blot分析顯示NSCLC腫瘤組織中的EPHB6蛋白水平降低(圖1C)。

圖1 EPHB6表達(dá)水平的測定Fig 1 Expression of EPHB6 in different groups

2.2 NSCLC中EPHB6高甲基化 實(shí)時(shí)定量RTPCR測定基因表達(dá)水平結(jié)果見圖2所示。序列分析結(jié)果表明，EPHB6的啟動子區(qū)富含CpG二聯(lián)體(圖2A)，與正常肺組織相比，腫瘤樣本的啟動子區(qū)及第一內(nèi)含子區(qū)有6處CpG島的核苷酸甲基化水平的升高(圖2B)，而NSCLC患者的樣本相對于正常肺組織顯示了較高水平的甲基化(P＜0.05，見圖2C)。EPHB6基因甲基化水平升高的腫瘤樣本EPHB6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低(r=-0.55，P＜0.05，見圖2D)?；蚣谆礁叩哪[瘤組織EPHB6的轉(zhuǎn)錄水平低(P＜0.05，見圖2E)。

在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上，A549細(xì)胞的EPHB6基因表達(dá)顯著上升(圖3A、B)，而EPHB6甲基化程度下降(圖3C)。

3 討論

本研究綜合運(yùn)用基于甲基化敏感的SmaⅠ限制性內(nèi)切酶的實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)、亞硫酸氫鹽測序?qū)嶒?yàn)和5-氮-2'-脫氧胞苷誘導(dǎo)基因重新表達(dá)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在NSCLC中EPHB6基因啟動子發(fā)生了較為廣泛的甲基化。EPHB6基因啟動子區(qū)的高甲基化與NSCLC中EPHB6 mRNA和蛋白質(zhì)水平的下調(diào)密切相關(guān)。EPHB6表達(dá)缺失與NSCLC患者早期發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)。從而，首次闡明了NSCLC中EPHB6表達(dá)失活的機(jī)制。

文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌中EPHB6啟動子區(qū)域的CpG島呈高甲基化狀態(tài)［13］。另外，還發(fā)現(xiàn)EPHB6基因第一個(gè)內(nèi)含子中的甲基化水平存在組織差異［17］。在SmaⅠ限制性內(nèi)切酶處理后，對照組的肺組織酶切片段擴(kuò)增水平顯著下降，而腫瘤樣本的酶切片段擴(kuò)增水平不變，從而進(jìn)一步證實(shí)了上述硫酸亞氫鹽測序?qū)嶒?yàn)的結(jié)果。我們對14例NSCLC患者的研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC樣本相對于正常肺組織顯示了較高水平的甲基化，而EPHB6基因甲基化水平升高的腫瘤樣本EPHB6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低的數(shù)據(jù)顯示甲基化和低表達(dá)有顯著的相關(guān)性，同時(shí)基因甲基化水平高的腫瘤組織EPHB6的轉(zhuǎn)錄水平降低。通過對經(jīng)過去甲基化試劑5-氮-2'-脫氧胞苷處理的A549細(xì)胞的EPHB6的表達(dá)水平進(jìn)行測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上，EPHB6基因的表達(dá)都顯著上升，這種表達(dá)上升與EPHB6的甲基化程度下降有關(guān)。

圖2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定基因表達(dá)水平Fig 2 Gene expression levels in NSCLC by RT-PCR

圖3 Aza處理后EPHB6 mRNA水平及其甲基化的變化Fig 3 Changes of EPHB6 mRNA and methylation in NSCLC after Aza treatment

基因的活性受到遺傳因素和表觀遺傳因素的雙重調(diào)節(jié)。表觀遺傳(epigenetic)因素雖然不改變DNA序列，但可以通過對DNA的修飾而降低相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性［18］。表觀遺傳因素可以導(dǎo)致EPHB6“量”的變化，即EPHB6表達(dá)水平的降低會導(dǎo)致缺乏足夠數(shù)量的分子來維持其正常的功能。目前已經(jīng)明確，腫瘤的轉(zhuǎn)移與多種癌基因的低甲基化過表達(dá)以及抑癌基因的高甲基化失活有關(guān)，甲基化導(dǎo)致基因沉默的頻率高于突變、缺失等造成的基因沉默［19，20］。DNA序列中的 CpG 二聯(lián)體是甲基化的靶點(diǎn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl transferase，DNMT)以CpG二聯(lián)體中的C為底物，將S腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到 C上，形成甲基化的mCpG。一些DNMT抑制劑被用于逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化。CpG二聯(lián)體以較大的密度分布于基因5'端，稱為CpG島。CpG島一般為0.5-2 kb長，通常位于基因的5'端啟動子區(qū)，也可延伸至外顯子區(qū)，CpG島的高甲基化將抑制該基因轉(zhuǎn)錄［23］。文獻(xiàn)報(bào)道在多種人類腫瘤中 EPHB6 表達(dá)均被抑制［13，15，22］，而EPHB6在乳腺癌細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄失活是啟動子區(qū)DNA高甲基化造成的［15］，從而表明EPHB6的高甲基化沉默可能在多種類型腫瘤當(dāng)中都會發(fā)生。

綜上所述，NSCLC中EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶因啟動子區(qū)高甲基化而沉默，EPHB6的失活與NSCLC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示通過降低EPHB6啟動子DNA的甲基化水平激活其表達(dá)，有可能為預(yù)防NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移提供新的方法。

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