一株拮抗細(xì)菌拮抗性能的測試與評價(jià)

賈翠英,王秀梅,張玉輝

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003；2.三門峽市湖濱果汁有限公司,河南三門峽 472000）

拮抗細(xì)菌（antagonistic bacteria）是指對某種細(xì)菌的生長繁殖有抑制作用的細(xì)菌,它主要通過產(chǎn)生拮抗物質(zhì)來發(fā)揮拮抗作用.目前應(yīng)用較多的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌Bacillus subtilis、假單胞桿菌Pseudomonasspp、土壤放射桿菌Agrobacterium radiobacter以及其它一些細(xì)菌[1].

拮抗細(xì)菌在代謝活動(dòng)中通過分泌抗菌物質(zhì)直接對病原菌的生長和繁殖產(chǎn)生抑制是自然界普遍存在的現(xiàn)象,也是眾多拮抗細(xì)菌應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ).拮抗細(xì)菌發(fā)揮作用的抗菌物質(zhì)多種多樣,但主要有2類：一是小分子的抗生素；二是大分子的拮抗蛋白或細(xì)胞壁降解酶類[2-3].隨著越來越多對拮抗細(xì)菌的關(guān)注,拮抗細(xì)菌的抑菌機(jī)制逐漸清楚,現(xiàn)在所熟悉的抑菌機(jī)制有拮抗作用、競爭作用、寄生作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）.拮抗作用是指拮抗細(xì)菌的同化作用產(chǎn)生能抑制病原菌的抑菌物質(zhì),一般在低濃度下就能對病原菌的生長和代謝產(chǎn)生抑制,引起細(xì)胞內(nèi)溶現(xiàn)象.測定拮抗細(xì)菌抑菌效果的主要方法有定性測定的擴(kuò)散法（如抑菌圈試驗(yàn)）和定量測定的稀釋法（如最低抑菌濃度試驗(yàn)）.大量研究表明[4-6],拮抗細(xì)菌菌株生長量與其抗菌物質(zhì)分泌成正相關(guān),可見菌株抗菌物質(zhì)是在菌株生長過程中分泌的代謝產(chǎn)物.

本研究通過抑菌圈試驗(yàn)測定抑菌圈直徑大小作為判定拮抗細(xì)菌的拮抗性能指標(biāo),考查培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響,篩選出該拮抗細(xì)菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基及合適的發(fā)酵條件,以期為進(jìn)一步研究和利用拮抗細(xì)菌更好地發(fā)揮其拮抗性能提供前提和參考.

1 材料和方法

1.1 菌種

試驗(yàn)所用拮抗細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn)室分離所得,并經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定屬于腸桿菌屬Enterobactersp.中的一種.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂18 g/L,pH7. 0；發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,pH7.0.

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將4℃冰箱內(nèi)保存的拮抗細(xì)菌轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)24 h,備用.

1.3.2 液體種子的制備 取2～3環(huán)活化的菌種,接入內(nèi)盛100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28℃,160 r/min培養(yǎng)24 h.

1.3.3 拮抗試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與優(yōu)化 取10mL拮抗細(xì)菌液體種子,接入內(nèi)盛100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,進(jìn)行最適碳源、最適氮源、最適無機(jī)鹽的篩選與優(yōu)化試驗(yàn),確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,然后利用所確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行拮抗試驗(yàn)進(jìn)一步確定最佳的抗菌條件.

1.3.4 抑菌活性的測定方法 利用移液槍吸取200μL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)入內(nèi)盛100mL滅菌冷卻至50℃的斜面培養(yǎng)基中,混勻,倒平板,冷卻至凝固,然后用內(nèi)徑為8mm的打孔器在平板上打孔,用移液槍吸取150μL拮抗細(xì)菌發(fā)酵液注入孔內(nèi),于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈大小,抑菌圈直徑越大表示抑菌活性越大[7-8].

2 結(jié)果與分析

2.1 最適發(fā)酵培養(yǎng)基確定

2.1.1 最適碳源的篩選 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,分別添加不同的碳源,質(zhì)量濃度為均3 g/L,所加碳源分別為葡萄糖、淀粉、玉米淀粉和蔗糖,以原始培養(yǎng)基發(fā)酵后進(jìn)行拮抗試驗(yàn)為對照,然后參照1.3.4所述進(jìn)行拮抗發(fā)酵試驗(yàn),通過測定發(fā)酵液對病原菌拮抗所產(chǎn)生的抑菌圈大小,確定最適碳源,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.

表1 不同碳源對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表1可知,該拮抗細(xì)菌的抑菌效果因碳源的有無及碳源的種類不同而變化,當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同碳源時(shí),其抑菌效果明顯增大,且以淀粉和玉米淀粉為碳源時(shí)抑菌效果要優(yōu)于蔗糖和葡萄糖.根據(jù)抑菌圈直徑大小順序,可知最適碳源為淀粉,其抑菌圈直徑為2.89 cm,與不加碳源相比抑菌效果提高了100.49%.此外,由表還可知,多糖作為碳源時(shí)比單糖更有利于拮抗細(xì)菌拮抗性能的表達(dá).

2.1.2 最適氮源的篩選 最適氮源篩選試驗(yàn)中所加氮源分別為酵母膏、尿素、氯化胺和蛋白胨,質(zhì)量濃度均為10 g/L,其余方法同2.1.1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 不同氮源對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表2可知,不同氮源的添加對拮抗菌的抑菌效果均有促進(jìn)作用,但不同氮源所產(chǎn)生的抑菌效果不同,比較抑菌圈直徑大小可知最適氮源為蛋白胨,其抑菌圈直徑為3.25 cm,由表中結(jié)果可知,有機(jī)氮源的添加比無機(jī)氮源更有利于拮抗細(xì)菌拮抗性能的表達(dá),其原因可能是無機(jī)氮源的部分揮發(fā)造成微生物的利用率較低.

2.1.3 最適無機(jī)鹽的篩選 最適無機(jī)鹽篩選試驗(yàn)中,分別用5 g/L的氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵代替原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉制成發(fā)酵培養(yǎng)基,并以原始培養(yǎng)基發(fā)酵后進(jìn)行拮抗試驗(yàn)為對照,其余方法同2.1.1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3 不同無機(jī)鹽對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表3可知,除錳離子對拮抗菌的抑菌效果沒有作用外,其它無機(jī)鹽離子如鐵、鎂、鈣和鈉離子對拮抗菌的抑菌效果均有促進(jìn)作用,比較抑菌圈直徑大小可知最適無機(jī)鹽離子為鈣離子,其抑菌圈直徑為2.44 cm.

2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化 以篩選出的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽為3個(gè)重要因素,選用三因素三水平L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)[9],正交試驗(yàn)因素及水平見表4、表5和表6.

表4 正交試驗(yàn)因素水平

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析

由表5可知,試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A2B3C1,即該拮抗細(xì)菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉3 g/L,蛋白胨12 g/L和氯化鈣3 g/L,極差分析可知,RB＞RC＞RA,各因子對抑菌活性影響大小為蛋白胨＞氯化鈣＞淀粉.其中,由表6方差分析進(jìn)一步可知,蛋白胨為顯著差異,氯化鈣和淀粉為不顯著差異.

2.2 最佳發(fā)酵條件的確定

利用上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行拮抗細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)過程中主要考查了培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、接種量及裝液量,通過進(jìn)一步拮抗試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)的條件.其中除考查不同單因素試驗(yàn)外,所有發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)均在250mL三角瓶中進(jìn)行,均采用10%接種量,40%裝液量,初始pH 7.0,28℃,180 r/min,24 h的培養(yǎng)條件.

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間的考查 分別對發(fā)酵培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行拮抗試驗(yàn),通過測定抑菌圈直徑大小來判斷拮抗性能,確定最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間,試驗(yàn)結(jié)果見表7.

表7 不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表7可知,拮抗細(xì)菌的抑菌效果隨發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng),并于發(fā)酵培養(yǎng)24 h抑菌效果最佳,繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間,抑菌效果開始減弱,其原因可能是該拮抗細(xì)菌所分泌的抑菌物質(zhì)是一種初級代謝產(chǎn)物,在細(xì)胞生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期前期產(chǎn)量最高.發(fā)酵培養(yǎng)的后期,由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏和一些次級代謝物質(zhì)及毒素副產(chǎn)物的積累對細(xì)胞生長產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致抑菌效果不明顯甚至下降.

2.2.2 初始pH的考查 將拮抗細(xì)菌分別接種到初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的優(yōu)化培養(yǎng)基中,并進(jìn)行抑菌活性的測定,并考查最適pH值.

表8 初始pH值對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表8可知,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為弱酸強(qiáng)堿都會(huì)引起拮抗細(xì)菌拮抗性能的下降,這主要是拮抗細(xì)菌自身的生理生化特性決定,即通常細(xì)菌生長的最適pH為中性偏堿.由表還可知,發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7.0～8.0之間時(shí)抑菌效果較明顯,抑菌圈直徑最大為2.67 cm.

2.2.3 接種量的考查 當(dāng)接種量分別為6%,8%,10%,12%,14%時(shí),拮抗細(xì)菌的抑菌效果見表9.

表9 發(fā)酵接種量對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表9可知,當(dāng)接種量為8%時(shí)抑菌圈直徑最大,為2.64 cm,而低于或高于8%接種量時(shí)抑菌效果都呈現(xiàn)下降的趨勢,可能是由于菌種濃度過高,營養(yǎng)物質(zhì)受限制所致.

2.2.4 裝液量的考查 分別將50mL、75mL、100mL、125mL、150mL的最適發(fā)酵培養(yǎng)基注入250mL的三角瓶中,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),然后進(jìn)一步進(jìn)行拮抗試驗(yàn),結(jié)果見表10.

表10 裝液量對拮抗細(xì)菌拮抗性能的影響

由表10可知,隨著裝液量的增加,拮抗細(xì)菌的拮抗性能逐漸增強(qiáng),當(dāng)裝液量為75mL～100mL之間時(shí),拮抗性能變化不明顯,但繼續(xù)增加裝液量,拮抗性能呈下降趨勢.表明該拮抗細(xì)菌是需氧型細(xì)菌,培養(yǎng)基內(nèi)溶氧水平越高,越適合產(chǎn)生更多抑菌物質(zhì).

3 結(jié)論與討論

菌體發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過程,受諸多因素的影響[10].為了使拮抗菌株具有較高的拮抗性能,不僅需要對其產(chǎn)拮抗物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行必要的優(yōu)化,而且還需要合適的發(fā)酵條件,以便促進(jìn)拮抗物質(zhì)更好地分泌.本研究通過采用單因素及正交試驗(yàn)法對拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化,并利用最適發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵條件的考查,通過測定所產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小作為評價(jià)拮抗菌株拮抗性能優(yōu)劣的指標(biāo).研究表明,該拮抗菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：淀粉3 g/L,蛋白胨12 g/L,氯化鈣3 g/L,培養(yǎng)條件為接種量8%,裝液量75mL/250mL,培養(yǎng)時(shí)間24 h,初始pH值為8.0,在此條件下,拮抗細(xì)菌表現(xiàn)出理想的拮抗性能,其抑菌圈直徑達(dá)2.6 cm左右.此研究將為更好地利用拮抗細(xì)菌進(jìn)行生防研究提供理論參考價(jià)值.

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