大孔吸附樹脂分離純化鎖陽總黃酮效果初探

張庭瑞，李志忠

(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050)

鎖陽(Cynomoriumsongaricum)又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球等，是鎖陽科鎖陽屬的單科單屬單種植物，多寄生于蒺藜科白刺屬(Nitraria)植物的根部，屬全寄生種子植物。系多年生肉質(zhì)草本，無葉綠素，呈紫紅色，大部埋于沙中。鎖陽中含大量黃酮類化合物[1]。黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌等多種生理活性及藥理作用[2]，且無毒無害，對人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的治療和預防有重要意義，還被用作食品、化妝品天然添加劑，如甜味劑、抗氧化劑和食用色素等[3-4]，因此，成為近年研究、開發(fā)和利用的熱點[5-7]。目前國內(nèi)外文獻尚未見對鎖陽總黃酮純化的報道。黃酮類化合物最常用的純化方法為層析柱法，主要利用大孔樹脂作為吸附材料。大孔吸附樹脂是20世紀60年代初開發(fā)的一類有機高聚物吸附劑，大孔吸附樹脂分離技術的應用原理主要是利用其吸附性和分子篩作用相結合，依靠其物理性質(zhì)(如比表面積、孔徑等)選擇性地吸附藥液中有效成分并去除雜質(zhì)。特點是吸附容量大、再生簡單、效果可靠[8]。大孔吸附樹脂分離技術被認為是提取分離中草藥中水溶性成分的一種有效方法[9]。該技術已比較廣泛地應用到中藥新藥的開發(fā)和中成藥的生產(chǎn)中，主要用于分離和提純苷類、黃酮類、生物堿成分及其大規(guī)模生產(chǎn)[10]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 鎖陽干燥肉質(zhì)莖(甘肅酒泉產(chǎn))、蘆丁標準品和AB-8型大孔吸附樹脂分別由甘肅酒泉市金鎖陽天然保健品有限公司、中國藥品生物制品檢定所和南開大學化工廠提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、氯仿均為分析純，甲醇為優(yōu)級純。

主要儀器設備包括：UV-9200型紫外可見分光光度計；AB104-N型電子分析天平；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋；TG16型高速臺式離心機；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；RE 52-88A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電子調(diào)劑萬用電爐；Galanz WP750型微波爐；JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機；BS-2F型振蕩培養(yǎng)箱；層析柱(Ф 15 mm×450 mm)。

1.2試驗方法

1.2.1樣品處理 用清水沖洗干凈，置于干燥箱中60 ℃恒溫干燥30 min，取出冷卻后粉碎，過0.15 mm篩，置干燥器中備用。

1.2.2標準曲線的繪制 以Na(NO3)2-Al(NO3)3-NaOH絡合顯色分光光度法在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線[11-12]。得回歸方程y=1.177 9x+0.005 2(r=0.999 75)和蘆丁含量y與吸光度x之間的回歸曲線(圖1)。

1.2.3AB-8型大孔吸附樹脂預處理 按下列步驟進行預處理：將樹脂以95%工業(yè)乙醇浸泡24 h后濕法裝柱；用95%工業(yè)乙醇沖洗(流速2 BV/h，BV為樹脂體積倍數(shù))洗至流出液與水以1∶2混合不產(chǎn)生混濁時，再用大量蒸餾水洗至洗液澄清；用2 BV 5% HCl液沖洗樹脂柱(流速4～6 BV/h)，然后用水以同樣流速洗至中性；用2 BV 2% NaOH液沖洗樹脂柱(流速4～6 BV/h)，然后用水同樣流速洗至中性[13]。

圖1 蘆丁對照品回歸曲線

1.2.4AB-8型大孔吸附樹脂純化粗提液 取備用鎖陽30 g，以70%乙醇600 mL在80 ℃下回流1.5 h，以500 W、20 s/20 s、60 s的條件超聲波處理2次；再以80 ℃回流1.5 h；減壓抽濾，并用少量30%乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液；在45 ℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇；將濃縮液以75 mL氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集每次水溶液；離心，取上清液，作為供試液備用。

1.2.5樹脂比吸附量的測定 取預處理的干樹脂43 g，裝入500 mL碘量瓶中，加入供試液185.6 mL，恒溫25 ℃，150 r/min，振搖吸附24 h。在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、24 h時吸取上清液，測定樣品中的總黃酮含量。

按公式A=(C1-C2)×V/W計算在t時刻內(nèi)樹脂對鎖陽總黃酮的比吸附量。式中，A為比吸附量(mg/g)；C1為吸附前供試液質(zhì)量濃度(mg/mL)；C2為吸附后上清液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣品液體積(mL)；W為干樹脂質(zhì)量(g)。按照“標準曲線繪制”項下的方法精密量取相應體積的稀釋液進行處理，測定吸光度[13]。

1.2.6比洗脫量的測定 將上述充分吸附后的樹脂，裝入層析柱內(nèi)，樹脂柱用120 mL蒸餾水沖洗后，用70%的乙醇洗脫，流速1 mL/min，收集乙醇洗脫液，測定其中所含的黃酮量[13]。

M=(C×V)/W式中，M為比洗脫量(mg/g)；C為洗脫液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣品液體積(mL)；W為樹脂質(zhì)量(g)。

2 結果

AB-8型大孔樹脂吸附10 h后對鎖陽總黃酮的比吸附量超過70%，最終穩(wěn)定比吸附量達81.933 mg/g(表1)，鎖陽提取液純化后純度達到972.775 mg/g，即97.278%。樹脂吸附達到飽和大約需10 h，且由最終洗脫液質(zhì)量濃度可得出該樹脂對鎖陽總黃酮的比洗脫量，最高可達53.164 mg/g。

表1 大孔吸附樹脂吸附濃度、純化結果及分析

3 討論與結論

黃酮類化合物是具有酚羥基的兩個苯環(huán)(A，B環(huán))通過中央3個碳原子連接而成的一系列化合物，植物體內(nèi)大部分與糖結合成苷類或碳糖基存在，有的以游離形式存在[5]。黃酮類化合物的溶解度因結構及存在狀態(tài)(苷或苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷)不同而存在差異，一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機溶劑及稀堿中，其中黃酮、黃酮醇、查爾酮等平面型黃酮類化合物分子間引力較大，難溶于水；而二氫黃酮、二氫黃酮醇及異黃酮等非平面型黃酮類化合物處于半椅子式結構，破壞了分子的平面性，分子間引力較小，其水溶性大于上述平面型黃酮類化合物。黃酮類化合物糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于熱水、甲醇、乙醇、稀堿溶液，而難溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等親脂性有機溶劑[14]。游離黃酮及黃酮苷一般都含酚羥基，故都可溶于堿中，加酸后又沉淀出來，可利用此性質(zhì)提取、分離黃酮類化合物[15]。本研究利用黃酮類化合物易溶于乙醇的特性，采用不同濃度和條件對其進行提純。

大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結合的分離材料，其吸附力與樹脂的比表面積、表面電性、能否與被吸附物形成氫鍵等有關，篩選原理是由于本身多孔性結構所決定[16]。在確定分離條件時，首先根據(jù)黃酮類化合物分子體積大小選擇了相適應的大孔吸附樹脂，其次根據(jù)黃酮類化合物中含有酚羥基確定了樹脂的型號(AB-8)和分離條件。洗脫劑選擇了最常用且極性較小的乙醇，因為對非極性的大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強[17]。

本研究利用AB-8型大孔樹脂對鎖陽提取液純化后，黃酮類化合物(即總黃酮)純度達到97.278%，比洗脫量可達到53.164 mg/g。表明AB-8型大孔樹脂對鎖陽總黃酮具有極好的吸附性能，用其純化鎖陽黃酮類化合物是可行的。同時，由于AB-8型大孔吸附樹脂具有吸附快、吸附容量大、洗脫率高、再生簡單、能多次重復使用等優(yōu)點[18]，而且本試驗具有設計簡單易操作，藥品普通易配備，方法標準易實現(xiàn)等明顯優(yōu)勢，因此具有較高的重現(xiàn)性。

綜合評價，AB-8型大孔吸附樹脂對鎖陽總黃酮吸附性能和解吸性能均好，具有較高的比吸附量、吸附速度和比洗脫量，且純化能力極強。說明弱極性的樹脂適合用于鎖陽總黃酮的分離純化。為使樹脂吸附法成功地應用于工業(yè)化生產(chǎn)，除選用性能優(yōu)良的吸附劑外，還要配合最佳的動態(tài)條件，才能獲得滿意的純化產(chǎn)物和分離效率，對此還需要進一步研究。

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