白三葉葉蛋白提取及純化工藝

呂宗友，趙國琦，蘇衍菁，鄔彩霞，陸 銀，王小山

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

蛋白質(zhì)缺乏是世界性的[1]。高等植物的葉片被認(rèn)為是最有前途的蛋白質(zhì)資源。植物蛋白因其廉價(jià)、資源豐富并能滿足人類和家畜對蛋白質(zhì)的需求，引起了人們極大的關(guān)注[2-3]。開發(fā)植物蛋白質(zhì)資源成為食品業(yè)和飼料業(yè)一個(gè)亟待解決的問題。

葉蛋白又稱綠色蛋白濃縮物(leaf protein concentration，LPC)，是以新鮮牧草或其他青綠植物的生長組織(莖、葉)為原料，經(jīng)打漿壓榨后利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)原理從其汁液中提取的高蛋白濃縮物[4]。白三葉(Trifoliumrepens)是一種豆科牧草，其青飼利用期長、粗蛋白質(zhì)含量高、管理粗放、柔軟細(xì)嫩，是重要的種植牧草和觀賞草坪草[5-7]。目前，牧草中的苜蓿(Medicagosativa)[8]、聚合草(Symphytumperegrinum)[9]、串葉松香草(Silpniumperfoliatum)[10]、酸模(Rumexacetosa)[11]、黑麥草(Loliumperenne)[12]的葉蛋白開發(fā)均有報(bào)道，而白三葉葉蛋白的研究較少。本試驗(yàn)通過對白三葉葉蛋白提取和純化條件的探討，為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 白三葉于2010年4月中旬采自揚(yáng)州大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)牧草標(biāo)本區(qū)。

1.2儀器 SGL-300食品料理機(jī)(天津達(dá)康電器公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；凱式定氮儀(天津玻璃儀器廠)，用于粗蛋白質(zhì)的測定，按照張麗英[13]提供的方法進(jìn)行；HSS-I(B)恒溫浴槽(成都儀器廠)；Sartorius酸度計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；SHB循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3試驗(yàn)步驟

1.3.1葉蛋白的提取步驟 均勻稱取鮮樣50 g，剪成1 cm左右的小段，按試驗(yàn)要求加入規(guī)定量的水，打漿4 min，用3層濾布壓濾漿液，棄草渣，將濾液調(diào)節(jié)到規(guī)定的pH值后于水浴中快速加熱至規(guī)定的溫度，恒溫不同的時(shí)間，得絮凝物，過濾得葉蛋白膏，65 ℃烘干得葉蛋白濃縮物成品(圖1)。

圖1 葉蛋白的提取步驟[1]

1.3.2葉蛋白提取單因素設(shè)計(jì) 分別以加熱時(shí)間、加熱溫度、pH值、料液比和酸的種類(表1)作為影響白三葉葉蛋白提取率及沉淀率的因素，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3葉蛋白提取的正交設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選4因素3水平作正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。由于料液比1∶5太浪費(fèi)水，所以舍棄該比例。

1.4計(jì)算及分析 葉蛋白提取率及蛋白提取率計(jì)算，采用張垚等[4]的研究方法。采用SPSS 16.0和Excel分析處理數(shù)據(jù)。

表1 單因素設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5葉蛋白的純化 分別使用四氯化碳、甲醇、無水乙醇、蒸餾水、丙酮5種試劑以料液比為1∶3浸洗新鮮提取的葉蛋白粗提物3 h，3 000 r/min離心10 min，沉淀烘干后測定其純化蛋白質(zhì)含量。每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1加熱時(shí)間對提取率的影響 提取率隨加熱時(shí)間的延長而提高，但各處理間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)加熱時(shí)間為9 min時(shí)，葉蛋白和蛋白提取率的增長均達(dá)到了最大，隨著提取時(shí)間的延長，兩項(xiàng)指標(biāo)均下降然后保持恒定(圖2)。

圖2 加熱時(shí)間對葉蛋白純化和提取率的影響

2.2加熱溫度對提取率的影響 隨著溫度的升高，葉蛋白和蛋白的提取率和提取量逐漸增加，當(dāng)提取的溫度增加到90 ℃時(shí)，其提取率均達(dá)最大值，但差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，葉蛋白和蛋白提取率下降(圖3)，但各溫度之間差異不顯著。

圖3 加熱溫度對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.3pH值對提取率的影響 當(dāng)pH值為4.0時(shí)，葉蛋白和蛋白提取率最大，差異均顯著(P<0.05)，之后隨著pH值的升高，其提取率均減少；在pH值升高到6.5時(shí)，提取率均最小，隨著pH值的進(jìn)一步升高，提取率基本不變(圖4)。

圖4 pH值對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.4料液比對蛋白提取率的影響 料液比對葉蛋白和蛋白提取率的影響不大，差異不顯著(P>0.05)。但當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，蛋白和葉蛋白提取率最大(圖5)。

2.5酸的種類對蛋白提取率的影響 當(dāng)試驗(yàn)中用硝酸調(diào)pH值時(shí)，葉蛋白和蛋白提取率均達(dá)最大值，但差異不顯著(P>0.05)。醋酸和硫酸的提取效果最差(圖6)。

圖5 料液比對葉蛋白和蛋白提取率的影響

圖6 酸對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.6正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 通過正交試驗(yàn)和極差分析可知：對于葉蛋白提取率來說，按照極差R的大小可得出影響主次因素為C>B>A>D，即pH值>溫度>時(shí)間>料液比；對葉蛋白沉淀率來說，影響主次因素為C>A>B>D，即pH值>時(shí)間>溫度>料液比(表3)。表中得出的最優(yōu)結(jié)果是加熱時(shí)間9 min，溫度80 ℃，pH值4.0，料液比1∶2。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)按照最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行提取時(shí)，葉蛋白提取率可達(dá)2.44%，葉蛋白沉淀率可達(dá)38.94%，正交設(shè)計(jì)所得出的為最優(yōu)工藝。

2.7不同純化劑對葉蛋白純化的影響 未使用純化劑時(shí)，葉蛋白的純度在50%左右。使用純化劑時(shí)，葉蛋白純度達(dá)到了70%左右。其中，純化劑對葉蛋白純度的影響依次為甲醇>乙醇>丙酮>四氯化碳>水，但各種純化劑之間差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

3 討論

3.1單因素對白三葉葉蛋白提取率的影響 葉蛋白的提取方法有水溶液提取法、加熱法、酸堿法、純蛋白質(zhì)沉淀法、鹽析法、凝聚劑沉淀法、超濾法、電濃縮法、反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法、有機(jī)溶劑沉淀法、發(fā)酵酸法等等。其中，直接加熱法和酸化加熱法是最常用的方法，兩種方法的蛋白提取率均較高，成本均較低，適合大劑量葉蛋白的提取[14-15]。有研究[16]表明，酸化加熱法能終止脫鎂葉綠素的形成而避免動物食用后產(chǎn)生過敏反應(yīng)，但該方法提取的葉蛋白絮凝物結(jié)構(gòu)疏松，不易過濾分離，同時(shí)還加速不飽和脂肪酸的氧化，使胡蘿卜素的損失增多。本試驗(yàn)在酸化加熱時(shí)發(fā)現(xiàn)，低pH值適合蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)沉淀及加熱鈍化了蛋白酶活性，從而使葉蛋白的提取率最高。葉蛋白的提取率與酸的種類有關(guān)，鹽酸沉淀的葉蛋白的量較硫酸，硝酸，醋酸大[17]；高莉[14]的研究也表明，鹽酸絮凝的情況下，馬齒莧(Portulacaoleracea)的葉蛋白提取率及沉淀率均增大，這與本試驗(yàn)中硝酸能提高葉蛋白的提取率的結(jié)果不一致，可能與植物種類不同有關(guān)。

加熱時(shí)間的長短影響葉蛋白的提取。試驗(yàn)中當(dāng)加熱時(shí)間小于9 min時(shí)，由于加熱時(shí)間過短，蛋白質(zhì)沉淀不完全，當(dāng)加熱時(shí)間大于9 min時(shí)，葉蛋白的沉淀不再增加，反而有減少的趨勢，這與王桓[16]的研究結(jié)果一致。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的絮凝是一個(gè)需要能量的反應(yīng)，隨著加熱時(shí)間的延長，沉淀所需的能量才能達(dá)到峰值，但當(dāng)達(dá)到所需能量的峰值之后，對反應(yīng)會造成負(fù)影響，使絮凝速度和絮凝的積累量都減少[4]。由于試驗(yàn)各種處理中得到的未純化葉蛋白蛋白質(zhì)含量基本一致，所以純化蛋白提取率的趨勢和葉蛋白也基本一致[4]。

溫度的高低影響蛋白質(zhì)的沉淀。本試驗(yàn)中當(dāng)溫度為90 ℃時(shí)，葉蛋白的提取率達(dá)到最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，葉蛋白的提取率反而下降，這可能是溫度升高雜質(zhì)沉淀量增加而導(dǎo)致葉蛋白的提取率下降[12]。

蛋白質(zhì)分子的電荷和溶解度可隨環(huán)境的pH值的變化而變化。pH值較低時(shí)，堿性氨基酸的支鏈功能基及酸性氨基酸的羧基質(zhì)子化，蛋白質(zhì)帶正電荷；pH值較高時(shí)，堿性與酸性功能基中的質(zhì)子被移除，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷；在某一特定pH值時(shí)，蛋白質(zhì)為電中性[8]。試驗(yàn)中當(dāng)pH值為4.0時(shí)，葉蛋白提取量達(dá)最大值，此時(shí)葉蛋白的溶解度最??；當(dāng)pH值接近中性時(shí)，大量的葉蛋白溶解，這與Dalev等[2]的研究結(jié)果一致。當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，更大量的葉蛋白溶解[14]。

影響葉蛋白提取率的最主要原因是其葉蛋白能否提取完全。理論上，當(dāng)料液比越大時(shí)，葉蛋白提取越完全，而適中的料液比能以最少的提取液獲得最大的葉蛋白。本試驗(yàn)中當(dāng)料液比小于1∶2時(shí)，葉蛋白未完全溶解，葉蛋白的提取率低；當(dāng)料液比為1∶3時(shí)，葉蛋白提取率較高；之后隨著料液比的增加，葉蛋白提取率不再增加。

3.2正交設(shè)計(jì)對葉蛋白提取的優(yōu)化 本試驗(yàn)中正交設(shè)計(jì)影響的主次因素為C>B>A>D，即pH值>溫度>時(shí)間>料液比。pH值在試驗(yàn)中占主要因素，這與吳峰華等[18]的研究結(jié)果一致。pH值在4.0時(shí)，葉蛋白質(zhì)處在等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零,顆粒無電荷間的排斥作用，易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，能迅速使最適溫度分別為55 ℃及45 ℃的血紅蛋白水解酶和羧肽酶鈍化，降低了蛋白質(zhì)的降解；當(dāng)溫度低于80 ℃時(shí)，由于溫度太低，部分巰基蛋白酶的活性仍很高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解損失升高；當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)又被溶解，導(dǎo)致溶解損失。但張垚等[4]的研究結(jié)果表明，溫度的影響較pH值的大，可能是因?yàn)橹参锓N類不同，其組成蛋白質(zhì)的氨基酸的酸堿性不同，受pH值的影響不同。

3.3葉蛋白的純化 葉蛋白中含脂化合物、葉綠素以及類胡蘿卜素等植物色素和導(dǎo)致葉蛋白有不良風(fēng)味和顏色的多酚類物質(zhì)，烘干后發(fā)黑，影響了其利用。有機(jī)溶劑可除去這些化合物[19]，且純化劑的使用能提高葉蛋白的純度近20%，粗制得到的葉蛋白呈墨綠色，經(jīng)過不同純化劑的純化后，產(chǎn)品色澤變淺，青草味消失，葉蛋白的蛋白質(zhì)含量明顯提高[20]。本試驗(yàn)的純化劑為醇類物質(zhì)時(shí)純化效果最好。黃威[21]也認(rèn)為醇類的濃度越高，蛋白質(zhì)的含量也越高，醇提法可除掉類脂化合物、葉綠素以及類胡蘿卜等植物色素和多酚化合物。水的效果最差，是因?yàn)槿~綠素類物質(zhì)不溶于水。

4 結(jié)論

白三葉葉蛋白單因素提取的最佳參數(shù)為加熱時(shí)間9 min，溫度90 ℃，pH值4.0，料液比1∶2，沉淀的酸為硝酸。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可知葉蛋白提取的最佳工藝為加熱時(shí)間為9 min，溫度為80 ℃，pH值為4.0，料液比為1∶2。純化葉蛋白的最佳試劑是甲醇，以料液比1∶3純化葉蛋白粗提取物最有效。

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