野生馬蹄金花粉生活力檢測方法比較

劉幫龍，張曉慧，干友民，賀嘯塵，莫 利

(四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 雅安 625014)

馬蹄金(Dichondrarepens)是旋花科馬蹄金屬的多年生匍匐型草本植物，喜溫暖濕潤氣候，多生于疏林地、林地邊緣及山坡、河岸和河灘的陰濕地段，呈片狀分布[1-2]。馬蹄金屬植物在全世界共有13個種，中國僅有1個種，該種主要分布在中國、東南亞及澳洲的一些國家[3]，我國是其分布的中心，主要分布于秦嶺-淮河以南的熱帶、亞熱帶地區(qū)[4-5]。馬蹄金植株低矮，葉形美觀，須根發(fā)達，具較多的匍匐莖，能節(jié)間著地生根，建坪容易，管理粗放，適應性廣，是目前國內(nèi)外應用廣泛的優(yōu)良地被兼觀賞植物。

花粉是高等植物的雄配子體，它在有性繁殖中傳遞著雄性親本的遺傳信息。不同類群植物花粉在自然條件下的壽命、適宜貯存條件以及花粉生活力的適宜測定方法均有所差異[6]。因此，掌握花粉生活力檢測的方法對于提高植物育種效率具有較高的實際應用價值。

國內(nèi)外對馬蹄金的研究主要集中在引進品種的形態(tài)、生理生態(tài)、適應性、栽培管理措施等方面[7-22]。而有關馬蹄金花粉活力等有性繁殖特性方面研究報道較少，且多是對生殖物候的初步觀察研究，周守標等[23]、干友民等[24]通過觀察西南地區(qū)野生馬蹄金材料生殖物候，發(fā)現(xiàn)材料間開花結(jié)實性有差異，部分坪用價值較好的材料存在僅開花不結(jié)實現(xiàn)象，這將阻礙優(yōu)異坪用馬蹄金品種培育和推廣。因此，本試驗以前期研究篩選出的坪用價值、抗逆性均表現(xiàn)較好，但結(jié)實性不同的野生馬蹄金材料SD200303(開花并結(jié)實)、GD200503(僅開花不結(jié)實)為研究對象，分別以碘-碘化鉀(I2-KI)染色法、聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法、2,3,5-氯代三苯基四氮唑(TTC)染色法和離體萌發(fā)法測定其花粉活力，比較4種方法測定效果的差異，篩選適宜馬蹄金花粉活力測定方法，為進一步研究野生馬蹄金有性繁殖特性提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1試驗材料 供試野生馬蹄金材料采自四川、貴州境內(nèi)不同生境，采集后移栽至四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場資源圃中擴繁；并記錄采樣點生境條件，植物群落構(gòu)成情況和土壤類型等。

參考研究小組前期對西南野生馬蹄金的坪用、生殖物候等研究結(jié)果[15-20]，從14份野生馬蹄金材料中，篩選出坪用特性、抗性等均較好，但結(jié)實性存在明顯差異的材料SD200303(結(jié)實)和GD200503(僅開花不結(jié)實)。

1.2試驗方法

1.2.1碘-碘化鉀染色法 花期取花藥剛開裂野生馬蹄金材料花粉粒，將少量花粉置于載玻片上，滴入一滴1%的碘-碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片染色，常溫下放置20 min后，Olympus顯微鏡(型號CX21)檢查著色情況，統(tǒng)計蓋玻片中央部5個視野花粉的著色情況，凡被染色呈藍色表示具有生活力，呈黃褐色者為發(fā)育不良生活力弱的花粉[25]，計算花粉活力百分率，重復3 次，取平均值。

表1 野生馬蹄金材料來源與編號

1.2.2聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法 先將0.2 g聯(lián)苯胺溶于100 mL 50%酒精，0.15 g 甲萘酚溶于100 mL 50%酒精，0.25 g碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水等量配制成混合溶液 I；接著配制0.3%過氧化氫溶液Ⅱ，然后載玻片上加少量待測花粉，滴溶液Ⅰ和溶液Ⅱ各一滴，仔細攪勻，蓋上蓋玻片，經(jīng)3～4 min后，Olympus顯微鏡(型號CX21)下檢查，統(tǒng)計蓋玻片中央部5個視野花粉的著色情況，有生活力的花粉呈紅色或玫瑰色，無生活力的花粉為黃色或無色[26]，計算花粉活力百分率，重復3 次，取平均值。

1.2.32,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法 花期取花藥剛開裂的野生馬蹄金材料花粉粒，將少量花粉置于載玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液(0.05 g TTC粉末溶解在10 mL pH值7.17的磷酸緩沖液中)，將此載玻片置于恒溫箱中(35～40 ℃)15～20 min后鏡檢，統(tǒng)計蓋玻片中央部位5個視野中紅色花粉所占的比例[24]，計算花粉活力百分率，重復3 次，取平均值。

1.2.4離體萌發(fā)法 以培養(yǎng)基離體培養(yǎng)法測定花粉活力，瓊脂培養(yǎng)基含蔗糖(設3個梯度：5%、10%、15%)+0.005%硼酸(HBO3)、0.015%硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]+0.001%硫酸鎂(MgSO4·7H2O)+0.005%硝酸鉀(KNO3)+0.5%瓊脂，將配制好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中待用，花期取花藥剛開裂的野生馬蹄金材料花粉粒均勻撒在制備好的培養(yǎng)基上，蓋蓋置于25 ℃暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.5 h后將培養(yǎng)皿置于Olympus顯微鏡(型號CX21)載物臺上觀察花粉萌發(fā)狀況，花粉管長度大于花粉直徑視為有活力花粉[24]，觀察5個視野，計算花粉萌發(fā)率，重復3次，取平均值。花粉萌發(fā)率即代表花粉活力。

2 結(jié)果

2.1碘-碘化鉀染色法 多數(shù)植物正常的花粉積累淀粉較多，而不正常的花粉則少。通常正常花粉用碘-碘化鉀染色后呈藍色，而發(fā)育不良畸形花粉則不積累淀粉或積累淀粉極少，當?shù)?碘化鉀染色時呈黃褐色。因此，根據(jù)呈色反應來間接測定花粉的正常與否和花粉生活力的差別。

正常的野生馬蹄金花粉粒通常呈球形或橢球型，個體大小近似，自然狀態(tài)下無色。利用碘-碘化鉀染色法測定花藥剛開裂供試野生馬蹄金花粉生活力，其花粉粒均被染成黃色或黃褐色，未見藍色，不能根據(jù)呈色反應來統(tǒng)計花粉生活力差異，因此，碘-碘化鉀染色法不適宜野生馬蹄金花粉活力測定(表2)。

2.2聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法 具有生活力的花粉含有活躍的過氧化物酶。此酶能利用過氧化物使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉有無活力，經(jīng)聯(lián)苯胺-甲萘酚染色后，具生活力的花粉含活躍的過氧化物酶，花粉呈紅色；活力弱的花粉含過氧化物酶較少，只能催化少量多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而被染成淺紅色；無活力的花粉不含過氧化物酶，因此不能產(chǎn)生催化反應。

聯(lián)苯胺-甲萘酚染色后的供試材料野生馬蹄金花粉在顯微鏡下呈現(xiàn)紅色、淺紅色、無色3種顏色反應，對花粉染色情況統(tǒng)計分析表明，GD200503花粉活力為38%，SD200303的花粉活力則為73%，是GD200503的兩倍(表2)。

2.32,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法 凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用過程中都有氧化還原反應，而無生活力的花粉則無此反應，因此當TTC滲入有生活力的花粉時，花粉中的脫氫酶在催化去氫過程中與TTC結(jié)合，使無色的TTC變成三苯基甲臢(TTF)而呈紅色。經(jīng)TTC染色后，供試野生馬蹄金材料花粉顏色均無明顯變化，未見明顯染色反應，且顏色差異小，不易分辨統(tǒng)計花粉活力差異。因此，該方法不適宜野生馬蹄金花粉活力測定(表2)。

2.4離體萌發(fā)法 在不同質(zhì)量分數(shù)蔗糖培養(yǎng)基上，野生馬蹄金材料花粉離體萌發(fā)率存在差異(表2)，其中SD200303的花粉在蔗糖分別為5%、10%和15%的培養(yǎng)基上均能萌發(fā)，在含10%蔗糖培養(yǎng)基上的花粉離體萌發(fā)率最高，達54.96%，花粉管生長良好，且花粉萌發(fā)率基本穩(wěn)定，便于觀察。而GD200503花粉離體萌發(fā)率在蔗糖為5%和15%的培養(yǎng)基中均不萌發(fā)，在蔗糖為10%的培養(yǎng)基中有少量萌發(fā)，離體萌發(fā)率較低，僅為2.43%，這可能與其本身花粉活力低有關，各處理間差異極顯著(P<0.01)。因此，野生馬蹄金花粉離體萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基為蔗糖10%+硼酸(HBO3)0.005%+硝酸[Ca(NO3)2·4H2O]0.015%+硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.001%+硝酸鉀(KNO3)0.005%+瓊脂0.5%。

2.54種野生馬蹄金花粉活力測定方法效果比較 綜合比較4種花粉活力測定方法的測定結(jié)果(表2)，碘-碘化鉀法和2,3,5氯代三苯基四氮唑染色法由于染色效果不佳，不易分辨，不利于區(qū)分統(tǒng)計花粉活力差異，不適宜野生馬蹄金花粉活力測定。聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法能使野生馬蹄金花粉粒呈現(xiàn)明顯變色反應，利于統(tǒng)計花粉活力，但隨著花粉生活力的喪失，該酶活性不消失，仍能染色，其測定結(jié)果與離體萌發(fā)法比較，測定值往往偏高。與染色法相比，離體萌發(fā)法的固體培養(yǎng)基為花粉萌發(fā)提供了更好的養(yǎng)分條件，花粉萌發(fā)率從開始萌發(fā)到在培養(yǎng)0.5 h內(nèi)，萌發(fā)率呈上升趨勢，之后基本保持不變。因此，作為快速簡便的野生馬蹄金花粉活力測定方法，離體萌發(fā)法更為可靠，能更加準確可靠地反映花粉活力。

表2 不同花粉活力測定方法測定結(jié)果比較

3 討論

利用染色法測定花粉生活力具有快速簡便的優(yōu)點，但受花粉自身特性(如花粉壁的厚薄，花粉外壁的組成物質(zhì)，花粉內(nèi)各種酶活性的強弱等)的影響較大，因此，不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測定。2,3,5-氯代三苯基四氮唑染色法檢測花粉生活力是應用較多的，很多植物材料例如錦帶花(Weigelaflorida)、芍藥(Paeonialactiflora)、刺五加(Eleutherococcussenticosus)的花粉生活力測定都適用[27-29]。碘-碘化鉀法測定花粉生活力時，其著色程度受花粉壁的薄厚和花粉內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉比例高低決定，如棉花(Gossypiumsp.)花粉用碘-碘化鉀染色就不著色[30]。但本試驗中碘-碘化鉀、2,3,5-氯代三苯基四氮唑?qū)σ吧R蹄金花粉染色效果不佳，可能由于花粉外壁太厚或花粉內(nèi)含物中支鏈淀粉含量較少等原因。

與染色法相比，離體萌發(fā)法雖然操作復雜，花粉不易涂抹均勻，耗時長，但花粉萌發(fā)測定的數(shù)據(jù)科學可靠，并可完全定量，幾乎適用于所有植物的花粉生活力測定，但不同的材料需要不同的培養(yǎng)基。蔗糖的作用是提供合適的滲透壓和花粉管形成所需能量，硼酸的作用是促進花粉管的萌發(fā)。本試驗比較了在不同蔗糖質(zhì)量分數(shù)條件下野生馬蹄金花粉離體萌發(fā)情況，篩選出適宜馬蹄金離體萌發(fā)的培養(yǎng)基配方，為野生馬蹄金花粉活力測定提供理論依據(jù)。

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