多因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞聯(lián)合白介素－2胸腔內(nèi)注射治療癌性胸腔積液的臨床療效觀察

王 娟，陶貞霞，劉榮英，曹艷麗，國(guó) 虹，蔡秀萍，許衛(wèi)星，王建華，吳秀然，李海玲

原發(fā)及轉(zhuǎn)移的肺部、胸膜腫瘤均可引起癌性胸腔積液。目前癌性胸腔積液多采用化療藥物胸腔內(nèi)注射治療，部分應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑如香菇多糖、白介素－2等胸腔內(nèi)注射治療［1－2］，但采用以上方法治療多維持時(shí)間短，且對(duì)全身腫瘤無(wú)治療作用。我科采用多因子誘導(dǎo)的殺傷 (CIK)細(xì)胞培養(yǎng)后全身應(yīng)用配合CIK細(xì)胞聯(lián)合白介素－2胸腔內(nèi)注射治療癌性胸腔積液，取得了良好的治療效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2008年6月—2010年12月我科收治的癌性胸腔積液患者15例，其中原發(fā)肺癌4例，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移3例，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 (DLBCL)肺轉(zhuǎn)移3例，腎癌肺轉(zhuǎn)移3例，急性白血病2例，原發(fā)病均經(jīng)手術(shù)切除后病理證實(shí)(急性白血病除外)。其中急性白血病、乳腺癌肺轉(zhuǎn)移、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤及3例肺癌患者均應(yīng)用常規(guī)化放療全身治療后效果不佳，1例原發(fā)肺癌患者拒絕再次應(yīng)用化療，腎癌患者為手術(shù)后1.5～2.0年，未接受其他治療。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)過程 應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)(COBE，美國(guó))分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞約3×109個(gè)，在百級(jí)無(wú)菌層流病房超凈工作臺(tái)上經(jīng)去漿、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液 (密度1.077 g/ml購(gòu)于天津?yàn)笊镉邢薰?分離單個(gè)核細(xì)胞，并應(yīng)用RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液 (購(gòu)于美國(guó)Gibco公司)洗滌2次 (1 500 r/min離心，15 min/次)后，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中 (購(gòu)于美國(guó) Costar公司)，放入37℃、5%CO2孵育箱中 (MCO－15AC日本三洋公司)，2 h后將懸浮細(xì)胞移入另外培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，加入CD3單抗 (武漢生物制品研究所)，γ－干擾素2 000 U/Ml(購(gòu)于上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)，計(jì)為D0天，D1天加入白介素－2 1 000 U/ml(購(gòu)于北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司)誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，每隔2～3 d換液1次，加入同量γ－干擾素、白介素－2，同時(shí)抽取離心后的上清液行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，放至37℃、5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)產(chǎn)品的回輸及鑒定

1.3.1 培養(yǎng)產(chǎn)品的回輸 在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的 D11、D13、D15天，如細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)陰性，活細(xì)胞＞95%，分次給患者回輸。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞懸液分裝入50 ml離心管中，1 500 r/min離心15min，去上清，加入含20 g/L人血清蛋白 (上海萊氏血液制品公司)的0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，將最后得到的細(xì)胞懸液留取(0.5～1.0) ×109聯(lián)合白介素－2胸腔內(nèi)注射外，將剩余細(xì)胞懸浮于250 ml含20 g/L人血清蛋白及白介素－2 2×105U的0.9%氯化鈉溶液中，回輸細(xì)胞數(shù)為 (1～3) ×109/次，通過輸血器經(jīng)靜脈輸注，輸注前予10%葡萄糖酸鈣、苯海拉明防治過敏反應(yīng)，記錄每次輸注CIK細(xì)胞后有無(wú)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、過敏及心肺功能變化。細(xì)胞培養(yǎng)過程中及細(xì)胞輸注后患者應(yīng)用白介素－2 200萬(wàn)U肌注，隔日1次，α－2b干擾素300萬(wàn)U肌注，隔日1次，總療程為40 d。

1.3.2 培養(yǎng)產(chǎn)品的檢定 細(xì)胞培養(yǎng)D0、D11、D13、D15天，經(jīng)流式細(xì)胞儀 (FACS C

alibur美國(guó)BD公司)進(jìn)行免疫表型測(cè)定，抽取培養(yǎng)物1 ml加入EDTA抗凝管，充分混勻，取50μl入流式細(xì)胞儀試管1～3，分別加入20μl鼠抗 IgG1－FITC/IgG2－PE/CD45－PerCP、CD3－FITC/－PE/CD45－PerCP、CD4－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP(試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司)，渦旋器充分混勻，避光孵育20～40 min，離心，磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌，過濾后，加入PBS 300μl上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所用流式細(xì)胞儀FACSCalibur，數(shù)據(jù)獲取采用Cell Quest3.2，所用蒸餾水、PBS、紅細(xì)胞裂解液均經(jīng)過0.2μm過濾網(wǎng)過濾，應(yīng)用鼠抗人IgG1－FITC/IgG2－PE/CD45－PerCP為對(duì)照設(shè)置樣本非特異熒光，即陰性對(duì)照，應(yīng)用淋巴細(xì)胞群的anti－CD4－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP調(diào)節(jié)各熒光的補(bǔ)償值，然后進(jìn)行細(xì)胞的測(cè)定及分析。

1.3.3 胸腔內(nèi)注射 胸腔積液經(jīng)B超定位后，盡量將胸腔積液抽凈后，注入CIK細(xì)胞 (0.5～1.5) ×109加入白介素 －2 100萬(wàn)U，隔日1次，每療程3次。

1.3.4 T細(xì)胞亞群檢測(cè) 細(xì)胞免疫治療前后抽取患者靜脈血1 ml加入EDTA抗凝管，充分混勻，取50μl入流式細(xì)胞儀試管1～5，分別加入20μl鼠抗 IgG1－FITC/IgG2a－PE、CD3－FITC/－PE、CD3－FITC/CD4－PE、CD3－FITC/CD8－PE、CD3－FITC/CD16－PE+(試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司)，渦旋器充分混勻，避光孵育20～40 min，離心，PBS洗滌，過濾后，加入PBS 300μl上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用T細(xì)胞亞群自動(dòng)分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 不良反應(yīng) 除11例患者有輕微發(fā)熱(體溫最高37.6℃，未用特殊處理自行降至正常)外，其他4例患者靜脈輸注過程順利無(wú)反應(yīng)，15例患者第1次胸腔注射后均有局部疼痛、胸腔內(nèi)燒灼感，第2次注射后癥狀減輕，所有患者均能很好地耐受該項(xiàng)治療。

2.2 CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中表型的變化經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表明，CIK細(xì)胞屬于異質(zhì)細(xì)胞群，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CIK細(xì)胞中、雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量大幅度上升 (見表1)。

2.3 患者T細(xì)胞亞群的變化 治療后患者外周血T細(xì)胞亞群顯示、、、均有升高，NK細(xì)胞 (雙陽(yáng)性細(xì)胞)較治療前明顯上升(見表2)。

表1 CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中表型的變化(±s，% ，n=15)Table1 The alteration of immunophenotype during the cultivation of CIK cells

表1 CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中表型的變化(±s，% ，n=15)Table1 The alteration of immunophenotype during the cultivation of CIK cells

注:與D0比較，*P＜0.01

CD+3 CD+8 CD+3 CD+56 D0 21.38±2.46 6.08±3.16 D11 40.67±4.56* 31.18±4.56*D13 42.14±5.37* 31.08±2.47*D15 54.27±6.90* 41.56±6.54*F 6.82 5.37 P值值＜0.05 ＜0.05

2.4 療效 15例患者共經(jīng)45個(gè)療程(每個(gè)療程間隔2～3個(gè)月)，經(jīng)1個(gè)療程治療后憋氣癥狀均明顯減輕，療程間隔期不需繼續(xù)抽取胸腔積液，14例患者2～3個(gè)療程后復(fù)查胸部CT，胸腔積液較前明顯減少，其中1例乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者治療2個(gè)療程后因加入其他藥物臨床協(xié)作組退出治療，1例急性白血病患者治療1個(gè)療程后因原發(fā)病復(fù)發(fā)，放棄治療自動(dòng)出院，1例肺癌患者治療2個(gè)療程后出現(xiàn)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)腫瘤內(nèi)科繼續(xù)治療，其余患者治療后2個(gè)月內(nèi)不再接受化療及放療，現(xiàn)已隨訪6～28個(gè)月，病情呈穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討論

生物治療是目前治療腫瘤的重要措施，其中細(xì)胞免疫治療是研究的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞免疫治療的研究始于20世紀(jì)80年代，人們陸續(xù)研究了淋巴因子激活的殺傷 (LAK)細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴 (TIL)細(xì)胞、CD3單克隆抗體 (單抗)激活的殺傷 (CD3AK)細(xì)胞等，體外研究均具有一定的殺瘤活性，但是由于細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)低，細(xì)胞毒力不強(qiáng)，故其臨床應(yīng)用受到很大的限制。1991年，Schmidt－wolf等［3］首先報(bào)道了 CIK細(xì)胞。它是將人外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子與CD3單抗共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一組異質(zhì)細(xì)胞，也稱自然殺傷 (NK)細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，CIK細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中的比例為1%～5%。其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞表面標(biāo)志 (CD3)，也有NK細(xì)胞表面標(biāo)志 (CD+56)，因而兼有T淋巴細(xì)胞抗瘤活性和NK細(xì)胞非人類主要組織相容性復(fù)合體 (major histocompatibility complex，MHC)限制性殺瘤的特點(diǎn)。應(yīng)用CIK細(xì)胞治療因其可大量擴(kuò)增，細(xì)胞毒活性強(qiáng)，可殺傷自體和異體多種腫瘤細(xì)胞，而且克服了過去過繼免疫療法的不足，如體外增殖數(shù)量少、需輸注白介素－2、低效及副作用大等，現(xiàn)已經(jīng)成為腫瘤生物治療的一種新方法。CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，源于其較高的存活率和強(qiáng)大的增殖能力。CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別結(jié)合是非T細(xì)胞受體 (TCR)和非MHC限制的。目前關(guān)于CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的原理尚未完全闡明，可能是通過黏附因子LFA/ICAM－1途徑與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，分泌含大量BLT酯酶的顆粒，這些顆粒能穿透靶細(xì)胞膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解［3］;而且 CIK細(xì)胞還能分泌白介素－2，白介素－6，腫瘤壞死因子－α及粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GMCSF)等一些細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用;CIK細(xì)胞同時(shí)可以上調(diào)CD2、CD18等黏附分子的表達(dá)，增加效應(yīng)細(xì)胞的免疫作用。此外，CIK細(xì)胞還可通過直接靶向腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷或誘導(dǎo)其凋亡。

表2 免疫治療前后患者T細(xì)胞亞群的變化(±s，%，n=15)Table 2 The alteration of T cell subset in patients of pre－immunotherapy and after－immunotherapy

表2 免疫治療前后患者T細(xì)胞亞群的變化(±s，%，n=15)Table 2 The alteration of T cell subset in patients of pre－immunotherapy and after－immunotherapy

CD+3 CD+4 CD+8 CD+19 CD+16 CD+56治療前 55.89±6.45 21.89±2.89 30.67±4.56 8.56±2.12 16.21±4.07治療后 73.47±2.56 39.05±6.45 33.25±6.74 45.67±3.85 39.04±7.32 t 5.65 3.98 2.79 8.96 5.47 P值值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

Schmidt－ Wolf［3］和黃文榮等［4］研究均發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞不是單一種類的細(xì)胞群，而是幾種細(xì)胞的混合群體。其主要細(xì)胞成分是細(xì)胞和細(xì)胞。CIK細(xì)胞來(lái)源于的T淋巴細(xì)胞在特定的細(xì)胞因子及環(huán)境下刺激形成，而不是體內(nèi)原來(lái)就存在的細(xì)胞或的NK細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CIK細(xì)胞主要來(lái)源于T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)，主要作用是特異性直接殺傷靶細(xì)胞［5］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量大幅度上升外，雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量亦有明顯的上升。這種自身CIK細(xì)胞對(duì)自身及異基因腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，并且在體外大量擴(kuò)增后回輸體內(nèi)，不需同時(shí)用白介素－2，故副作用小，因此有潛在的臨床研究與應(yīng)用價(jià)值［6］。在我們的前期研究中，應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，其中貼壁細(xì)胞培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞 (DC)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)CIK細(xì)胞，DC采用淋巴引流部位皮下注射，CIK細(xì)胞經(jīng)靜脈全身輸注，該種治療與傳統(tǒng)的DC－CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)后靜脈全身應(yīng)用相比，避免了不成熟DC靜脈應(yīng)用可能導(dǎo)致的免疫耐受，提高了治療效果［7］。由于DC、CIK細(xì)胞混合應(yīng)用治療費(fèi)用較高，對(duì)于經(jīng)濟(jì)較困難患者，我們采用單純CIK細(xì)胞培養(yǎng)，并在以往惡性腫瘤類型研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步擴(kuò)大了惡性腫瘤的類型 (如急性白血病等)及患者的治療例數(shù)，除將CIK細(xì)胞靜脈全身應(yīng)用外，我們首次采用CIK細(xì)胞聯(lián)合白介素－2胸腔內(nèi)注射直接到達(dá)患處殺傷腫瘤細(xì)胞，不僅患者治療前后外周血T細(xì)胞亞群顯示NK細(xì)胞雙陽(yáng)性細(xì)胞)較治療前明顯上升，主動(dòng)抗腫瘤的免疫功能提高，患者的臨床癥狀、影像學(xué)均提示病變較前好轉(zhuǎn)，提示該種治療方法對(duì)癌性胸腔積液是安全有效的，有良好的應(yīng)用價(jià)值。