視網(wǎng)膜色素變性患者視紫紅質(zhì)基因突變分析

劉 逾，賈曉林，李進(jìn)軍，盧立志，劉曉玲

視網(wǎng)膜色素變性 (Retinitis pigmentosa，RP)是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退化、視網(wǎng)膜色素上皮變性、外層視網(wǎng)膜進(jìn)行性退化所致的常見遺傳性致盲眼底病。在世界范圍內(nèi)該病發(fā)病率約為1/3 500［1］，我國(guó)群體患病率約為 1/3 784［2］，且呈逐年上升趨勢(shì)，已成為臨床上最常見且危害最嚴(yán)重的致盲性眼遺傳病之一。RP的遺傳方式復(fù)雜多樣，非綜合征RP中至少有4種遺傳方式，其中30%為常染色體顯性遺傳 (ADRP)，20%為常染色體隱性遺傳 (ARRP)，15%為X連鎖遺傳 (XLRP)，另有5%早發(fā)型RP即隱性Leber's先天性黑蒙 (LCAⅡ型)。當(dāng)患者因缺乏家族史而無(wú)法確定其遺傳方式時(shí)，將其定義為散發(fā)型RP(SRP)，約占30%［3］。多數(shù)RP為單基因遺傳，但也存在二基因－雙等位基因和二基因－三等位基因遺傳方式［4］。迄今為止，通過連鎖分析和候選基因篩選等方法已確定了19個(gè)ADRP、27個(gè)ARRP和6個(gè)XLRP基因位點(diǎn)，其中35個(gè)基因已被克隆。視紫紅質(zhì) (RHO)基因是最早發(fā)現(xiàn)的ADRP致病基因，同時(shí)也是 ADRP患者最常見的致病基因。大約26.5%的ADRP患者由RHO基因突變引起［3］，亞洲報(bào)道的突變率低于歐美，我國(guó)ADRP患者約有7%由RHO基因突變引起［5］。文獻(xiàn)報(bào)道RHO基因突變也可導(dǎo)致ARRP，不過發(fā)生頻率較小，不足1%［6］。為進(jìn)一步明確RHO基因在中國(guó)人中的突變特征與頻率，本研究對(duì)收集的RP患者進(jìn)行RHO全基因多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增，直接雙向測(cè)序及基因突變檢測(cè)分析，以期獲得中國(guó)RP患者RHO基因突變頻率及特征，探討其在RP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年3月—2010年10月溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院門診收治的55例RP先證者為研究對(duì)象，均為漢族，男31例，女24例，初診年齡5～71歲，平均年齡35歲，其中ADRP 6例、ARRP 14例、SRP 35例，分布于中國(guó)華南地區(qū)。RP診斷的確立依據(jù)國(guó)內(nèi)外通用標(biāo)準(zhǔn):(1)夜盲史;(2)視力逐漸下降;(3)眼底檢查可見骨細(xì)胞樣或不規(guī)則的色素沉著，視網(wǎng)膜血管縮窄和視盤顏色蠟黃或變淡;(4)全視野視網(wǎng)膜電圖 (ERG)明、暗視活動(dòng)時(shí)，桿體細(xì)胞功能降低，有時(shí)可見錐體細(xì)胞功能輕度降低，晚期桿體、錐體細(xì)胞功能均可降低。(5)視野縮窄或有環(huán)行暗點(diǎn)特征性改變和 (或)適應(yīng)曲線閥值升高，或視網(wǎng)膜桿體相缺如［7］。同時(shí)本研究隨機(jī)收集55名健康成年人為對(duì)照組，其中男35例，女20例，年齡18～50歲，平均年齡32歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床研究 全面調(diào)查病史并繪制家系圖，進(jìn)行詳細(xì)的眼科檢查，行ERG及視野檢查。

1.2.2 樣品采集 對(duì)RP患者及對(duì)照者行全面系統(tǒng)檢查，排除其他系統(tǒng)疾病，采集靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝、－70℃保存。根據(jù)世界醫(yī)學(xué)會(huì)《赫爾辛基宣言》涉及人類受試者的醫(yī)學(xué)研究的倫理原則及知情同意原則，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2.3 RP組DNA提取 采用蛋白酶K法提取白細(xì)胞DNA，干燥回收的DNA用TE緩沖液溶解備用，－20℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 運(yùn)用primer 5.00軟件 (PREMIER Biosoft International)對(duì)RHO基因序列 (Genbank NC_000003.11)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增RHO基因全序列，交上海英俊生物技術(shù)公司合成 (見表1)。

表1 RHO基因PCR引物堿基序列Table 1 PCR primer sequences for the RHO gene

1.2.5 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系:10×Buffer 2.5μl，MgCl2(含 MgCl210 mmol/L)1.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μl，ExTaq(5 U/μl)0.25μl，上下游引物 (10 mmol/L)各0.4 μl，DNA模板1.5μl，加超純水至25μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，63.5～66.0℃退火40 s，72℃延伸150 s，35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)均在德國(guó)Biometra儀器上進(jìn)行，反應(yīng)試劑均來(lái)自大連寶生物公司(TaKaRa公司)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，同時(shí)加Maker標(biāo)記DNA相對(duì)分子量，透射紫外線觀察DNA電泳帶凝膠成像儀照相，計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，以證實(shí)該擴(kuò)增片段。

1.2.6 DNA測(cè)序分析 對(duì)擴(kuò)增出的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后進(jìn)行直接的正、反雙向測(cè)序分析 (上海英俊生物技術(shù)公司ABI3170自動(dòng)測(cè)序儀)。采用Chromas2.31軟件查看測(cè)序結(jié)果，并采用DNAStar軟件 (DNAStar version 6，0，3，99)進(jìn)行比對(duì)分析。突變的命名參照國(guó)際統(tǒng)一的人類基因突變命名系統(tǒng)［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多重比較的P值由Bonferroni檢驗(yàn)校正。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)每一個(gè)檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)是否符合Hardy－Weinberg平衡進(jìn)行分析?；蛐皖l率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 所有研究對(duì)象DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增及2%瓊脂糖凝膠電泳后，均顯示單一條帶，所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致，表明是所需的產(chǎn)物 (見圖1)。

2.2 DNA測(cè)序及分析結(jié)果 應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)，采用Chromas2.31軟件查看測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)分析 (見圖2)，共檢出7種堿基變異，均符合Hardy－Weinberg平衡。其中2種為錯(cuò)義突變，V104I僅在RP組出現(xiàn)，A299S在RP組及對(duì)照組中各有1例。其余5種為非編碼區(qū)突變，且在對(duì)照組中也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)堿基突變，考慮為SNP，在NCBI－SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，兩組各SNP位點(diǎn)突變頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 檢出的RHO基因點(diǎn)突變Table 2 RHO sequence alterations detected in the study

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of agarose gel amplified by PCR

圖2 先證者RHO基因7個(gè)突變序列和對(duì)照者RHO基因7個(gè)堿基位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Figure 2 A graph of7mutation sequence of rhodopsin gene in proband and graph of 7 bases of rhodopsin gene in normal control

3 討論

RHO基因位于人染色體3q21～24，由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)由348個(gè)氨基酸組成的視蛋白，這是一個(gè)在視覺光電轉(zhuǎn)化過程中起作用的G－蛋白偶聯(lián)受體。RHO基因突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常或糖基化改變的視蛋白的產(chǎn)生，該蛋白滯留在感光細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不能運(yùn)輸?shù)揭晽U細(xì)胞外節(jié)盤膜中，或者該視蛋白由于結(jié)構(gòu)異常不能折疊，而不能整合入盤膜或引起盤膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而發(fā)生變性，導(dǎo)致RP［9］。自1990年Thaddeus等［10］報(bào)道RHO基因突變與某些 ADRP的發(fā)病有關(guān)以來(lái)，目前已發(fā)現(xiàn)100余種RHO基因突變，其中約90%為單個(gè)堿基置換的點(diǎn)突變，改變了RHO蛋白分子的單個(gè)氨基酸而致病，少數(shù)是微小缺失或插入突變。

本研究在1例SRP患者和1例ADRP患者中檢出錯(cuò)義突變V104I，對(duì)照組55名健康成年人未檢出此突變。Macke等［11］曾通過家系分析報(bào)道該突變?yōu)榉侵虏〉腻e(cuò)義突變。本研究在1例42歲男性ADRP患者及1例對(duì)照者RHO基因上檢出錯(cuò)義突變A299S。張曉莉等［12］曾報(bào)道在1例RP患者及2例正常對(duì)照組成員中檢出該突變，也系非致病的錯(cuò)義突變。迄今為止國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的非致病錯(cuò)義突變共3個(gè)，除本研究檢出的V104I、A299S外，另一個(gè)相似突變?yōu)镻220L［10］。文獻(xiàn)報(bào)道65種脊椎動(dòng)物的RHO蛋白中有27種第299位氨基酸為丙氨酸［13］，其余均為絲氨酸［14］，而絲氨酸也可以看做是丙氨酸的羥基化形式，以此解釋A299S突變?cè)赗HO基因上屬正常的多態(tài)變化，但對(duì)于其他兩種非致病錯(cuò)義突變的機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。這些錯(cuò)義突變改變了RHO基因的氨基酸序列，引起RHO分子結(jié)構(gòu)和功能異常，雖然已有家系報(bào)道為非致病突變，但其機(jī)制不明。本研究未檢出其他錯(cuò)義突變，我們預(yù)測(cè)RHO基因在中國(guó)華南地區(qū)RP患者中的突變率較低。

除錯(cuò)義突變，本研究在RHO非編碼區(qū)檢出多個(gè)突變位點(diǎn)，在NCBI－SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索均為已報(bào)道的SNP位點(diǎn)，RP組與對(duì)照組各SNP位點(diǎn)發(fā)生頻率均無(wú)顯著差異。RP遺傳學(xué)機(jī)制復(fù)雜，其候選基因確切致病機(jī)制及相互作用關(guān)系尚不清楚。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們認(rèn)為在內(nèi)含子與外顯子交界處的內(nèi)含子突變會(huì)導(dǎo)致外顯子的缺失或內(nèi)含子不被剪切，發(fā)生在內(nèi)含子中間的變異也多會(huì)因?yàn)榧せ盍穗[性剪切位點(diǎn)而影響了正常剪切從而致病［15］。王丹藝等［16］對(duì)151例香港地區(qū)漢族 RP先證者和150例對(duì)照者進(jìn)行了RHO基因和RP1基因全編碼區(qū)和鄰近剪切位點(diǎn)的內(nèi)含子區(qū)域序列突變的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)RHO基因非編碼區(qū)－26G＞A突變僅在RP組中出現(xiàn)，其發(fā)生率在RP組中顯著高于對(duì)照組，提示SNP與RP的危險(xiǎn)性增加有關(guān)。本研究中也檢出－26G＞A突變，但其在RP組和對(duì)照組中的發(fā)生率無(wú)顯著差異。雖然本研究所檢測(cè)出的非編碼區(qū)突變與對(duì)照組差異不顯著，但仍然應(yīng)該對(duì)內(nèi)含子在RP發(fā)病機(jī)制中所起的作用引起重視。迄今人們對(duì)RP的研究和認(rèn)識(shí)越來(lái)越多［17］，特別是對(duì)內(nèi)含子及其功能、發(fā)生在內(nèi)含子的基因突變與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)性的研究給RP的遺傳病因?qū)W研究帶來(lái)了全新的概念。如果發(fā)生在內(nèi)含子的基因突變與RP發(fā)病的相互作用被證實(shí)，對(duì)于RP的發(fā)病機(jī)制將有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

本研究檢出兩種已報(bào)道的非致病錯(cuò)義突變，5種非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)新的錯(cuò)義突變，我們由此預(yù)測(cè)RHO基因在中國(guó)華南地區(qū)RP患者中的突變率低于國(guó)外報(bào)道。本研究尚有不足之處，首先樣本量較小，沒有發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，其次未對(duì)檢出錯(cuò)義突變的先證者進(jìn)行進(jìn)一步家系研究，以確定檢出的錯(cuò)義突變?cè)谠撓茸C者家系中是否垂直傳遞，僅能參考文獻(xiàn)報(bào)道。進(jìn)一步研究應(yīng)盡可能的擴(kuò)大樣本量，爭(zhēng)取全基因組檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)錯(cuò)義突變患者進(jìn)行家系研究，以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。

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