尿酸對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制

宋彥索愛(ài)琴丁旭萌王天虎楊國(guó)東賈蘭梅

·論 著·

尿酸對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制

宋彥*索愛(ài)琴△丁旭萌*王天虎*楊國(guó)東*賈蘭梅*

目的 觀察尿酸對(duì)阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探討作用機(jī)制。方法 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出90只大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，尿酸處理組（1～4組），每組15只。Aβ1－42海馬注射制作AD模型，用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察干預(yù)前后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒測(cè)定海馬區(qū)MDA的含量；免疫組化染色測(cè)定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（caspase-3）的表達(dá)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降（P＜0.01），海馬區(qū)MDA含量和caspase-3明顯增高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，2種劑量尿酸處理組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善（P＜0.01），海馬區(qū)MDA和caspase-3的表達(dá)減少（P＜0.01）。結(jié)論 尿酸具有改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶作用，可能與抗氧化應(yīng)激作用及抑制海馬中caspase-3表達(dá)有關(guān)。

尿酸 阿爾茨海默病 學(xué)習(xí)記憶 丙二醛 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）好發(fā)于中老年人的一種常見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)在AD發(fā)病中起重要作用［1］。尿酸是一種重要的生理性的天然抗氧化劑，具有抗氧化應(yīng)激和保護(hù)神經(jīng)元的作用。本實(shí)驗(yàn)探討尿酸（uric acid，UA）對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制，為研究AD的發(fā)病機(jī)制及臨床應(yīng)用UA治療AD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的90只Sprauge-Dawley（SD）大鼠，雄性、健康、體質(zhì)量（280±12）g。Aβ1－42（美國(guó)Sigma公司），500 μg Aβ1-42溶于125 μL滅菌生理鹽水中，制成4 μg／μL濃度，置于－70℃超低溫冰箱中保存，用前置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1周，使其成為凝聚態(tài)Aβ1-42。尿酸、兔抗鼠caspase-3單抗為美國(guó)Sigma公司；尿酸檢測(cè)試劑盒（南京建成）；SP免疫組化染色試劑盒、丙二醛（MDA）氧化應(yīng)激檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 大鼠尿酸水平測(cè)定 SD大鼠尾靜脈采血約1 mL于抗凝管內(nèi)，在離心機(jī)內(nèi)離心15 min，轉(zhuǎn)速5000 r／min，離心后取200 μL上清液于EP管，檢測(cè)尿酸水平。

1.3 動(dòng)物的分組與模型的制備 測(cè)定大鼠的血尿酸水平［2］在（1±0.1）mg／kg生理范圍內(nèi)，經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出90只大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，尿酸處理組（尿酸處理1～4組），每組15只。10%水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉SD大鼠，將其固定于立體向儀上，使前后囟位于同一水平面上。參照《大鼠腦立體定位圖譜》［1］，定位于前囟后3.0 mm、正中矢狀縫左右旁開(kāi)3.0 mm、顱骨表面下3.5 mm為雙側(cè)海馬背側(cè)注射點(diǎn)。用10 μL微量注射器10 min內(nèi)緩慢將Aβ1－42注入模型對(duì)照組和尿酸處理組，空白對(duì)照組注射等容積的生理鹽水，所有大鼠海馬內(nèi)注射Aβ1－42每側(cè)均為2.5 μL（4 μg／μL），留針10 min，然后緩慢退出，縫合皮膚。造模成功后第1～21 d尿酸處理1～4組分別腹腔注射1、5、10、20 mg／（kg·d）的尿酸，空白對(duì)照組與模型對(duì)照分別腹腔注射等劑量生理鹽水。 在治療的21 d期間中，模型對(duì)照組、尿酸處理2、4組各死亡1只大鼠，余下87只是合格的。大鼠行為學(xué)的變化可以證實(shí)造模成功，即Aβ1-42海馬區(qū)注射是成功的。

1.4 空間記憶能力檢測(cè) 造模后第22 d采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行空間記憶能力的測(cè)定。測(cè)定程序?yàn)槎ㄎ缓叫性囼?yàn)：每天上午各訓(xùn)練2次，共訓(xùn)練16次，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)點(diǎn)放入水中，記錄其在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間和路程，即逃避潛伏期。空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)后去除平臺(tái)，然后任選一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠放入水池中，記錄其在3 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 取材 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后即造模后第23 d，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（300 mg／kg），將大鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，暴露心臟，經(jīng)主動(dòng)脈灌注后用剪刀快速由頸部剪下大鼠頭顱，將腦組織從顱腔內(nèi)移出置于4%多聚甲醛固定2～4 h，然后置于30%蔗糖溶液，待沉底后取出大腦，沿中線離斷兩側(cè)大腦半球，用竹刀沿海馬的包膜分離出兩側(cè)完整的海馬，冰生理鹽水充分沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重，置于液氮中保存。每組中取7只大鼠的雙側(cè)海馬制作切片，常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。

1.6 MDA測(cè)定 每組中取8只大鼠海馬用組織勻漿器制成組織勻漿，以12000 r／min低溫離心15 min，取上清液，MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定MDA的含量。

1.7 caspase-3免疫組化染色 免疫組化染色用SP法，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，DAB顯色系統(tǒng)，鏡下觀察顯色情況。陰性對(duì)照組以PBS代替一抗進(jìn)行孵育。每只動(dòng)物選取相似平面的切片各5張，運(yùn)用網(wǎng)格目鏡測(cè)試，于40×10倍光鏡下分別計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)單位面積內(nèi)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，每張切片分別選取雙側(cè)海馬視野各2個(gè)，取其均數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)采用最小有意義的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 各組之間潛伏期、搜索路徑長(zhǎng)度、跨越原平臺(tái)次數(shù)不等或不全相等（分別 F＝12.345，P＜0.01；F＝35.40，P＜0.01；F＝11.20，P＜0.01）。與 空白對(duì)照組組比較，模型對(duì)照組和尿酸處理1～4組學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，尿酸處理2、3組學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)（P＜0.01），模型對(duì)照組和尿酸處理1、4組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；尿酸處理1～4組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尿酸處理2、3組學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)（見(jiàn)表1）。

2.2 MDA含量檢測(cè) 各組之間MDA含量不等或不全相等 （F＝7.18，P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和尿酸處理1～4組MDA含量增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，尿酸處理2、3組MDA含量減少（P＜0.01），尿酸處理 1、4組與模型對(duì)照組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.01）；尿酸處理1～4組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尿酸處理2、3組MDA含量減少（見(jiàn)表2）。

2.3 各組caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 各組之間caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不等或不全相等（F＝35.78，P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和尿酸處理1～4組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，尿酸處理2組、尿酸處理3組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），尿酸處理1、4組與模型對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；尿酸處理4組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），尿酸處理2組、尿酸處理3組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少（見(jiàn)表3、圖1）。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力成績(jī)（±s）

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力成績(jī)（±s）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組尿酸處理1組尿酸處理2組尿酸處理3組尿酸處理4組n 15 14 15 14 15 14潛伏期（s）7.0±2.8 38.2±15.9 35.3±13.4 18.6±5.3 17.3±5.2 30.6±12.7搜索路徑長(zhǎng)度（cm）105±35 324±39 315±37 219±29 216±28 309±33跨越原平臺(tái)次數(shù)（次）18.5±6.5 14.3±3.5 13.9±3.2 16.9±6.2 17.2±5.9 13.7±3.2

表2 各組大鼠海馬區(qū)MDA含量

表3 各組大鼠caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)（1個(gè)400倍視野）

3 討論

到目前為止，AD的病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激［2］在AD的發(fā)病中起重要作用。氧化應(yīng)激可造成大量活性氧的產(chǎn)生，表現(xiàn)為血清中MDA含量升高和SOD活力、GSH-PX活力降低，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝失衡，并繼發(fā)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。Butterfield等［4］的實(shí)驗(yàn)表明，AD模型鼠腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)。林玉坤等［5］研究表明輕微認(rèn)知障礙患者腦中即可發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氧化和脂質(zhì)的過(guò)氧化。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的敏感指標(biāo)，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終通路［6］。尿酸是嘌呤的代謝終產(chǎn)物，是一種重要的生理性的天然抗氧化劑、鐵螯合劑、自由基清除劑，能通過(guò)多種途徑抑制一系列繼發(fā)性損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有抗氧化應(yīng)激和保護(hù)神經(jīng)元的作用［7］，這在AD動(dòng)物模型中也得到了證實(shí)［8］。相反，也有研究報(bào)道尿酸水平過(guò)高，反而會(huì)增加氧化損傷［9］。

尚秀麗等［10］測(cè)定32例AD患者顯示較低血尿酸水平，國(guó)外Polidori等［11］和Kim等［12］研究證實(shí)AD和輕度認(rèn)知障礙患者血尿酸也處于較低水平。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高血漿濃度水平的尿酸能夠降A(chǔ)D的發(fā)病率，改善AD患者的認(rèn)知功能障礙及AD患者的預(yù)后［13］。但Schretlen等［14］對(duì)共住一處有96例AD患者進(jìn)行研究表明高于正常水平尿酸的人員也存在記憶和認(rèn)知功能的減退。

基于尿酸具有抗氧化的作用和AD血清中低尿酸水平特點(diǎn)，我們用不同劑量的尿酸腹腔注射治療AD模型大鼠，結(jié)果表明：5、10 mg／（kg·d）兩種劑量尿酸處理組大鼠的潛伏期和搜索路徑較模型組明顯縮短（P＜0.01），跨越平臺(tái)次數(shù)較模型組增加（P＜0.01），認(rèn)知功能明顯改善（P＜0.01）；模型組大鼠海馬區(qū)的MDA含量和凋亡因子caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)，而5、10 mg／（kg·d）兩種劑量尿酸處理組大鼠海馬組織中MDA含量和caspase-3表達(dá)明顯下降（P＜0.01），差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可見(jiàn)，尿酸具有抗氧化作用，抑制了大鼠海馬組織Caspase-3的表達(dá)，從而減輕海馬組織的損害，改善了大鼠的認(rèn)知功能。

圖1 免疫組化染色SABC法檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺10 μm A：空白對(duì)照組，caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元少；B：模型對(duì)照組，caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元增多；C：5 mg／（kg·d）尿酸干預(yù)組，caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元較多

該研究表明尿酸改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力存在量效關(guān)系，5、10 mg／（kg·d）組改善學(xué)習(xí)記憶能力最佳，超過(guò)此劑量范圍保護(hù)作用降低甚至消失，其機(jī)制可能是尿酸在一定范圍內(nèi)具有抗氧化應(yīng)激能力，保護(hù)海馬神經(jīng)元，從不同途徑影響到大腦皮質(zhì)功能最終改善認(rèn)知功能，表明對(duì)尿酸水平的調(diào)控，對(duì)于改善AD認(rèn)知功能、延緩病情進(jìn)展，提高療效具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)的不足之處是沒(méi)有設(shè)置高尿酸血癥大鼠作為對(duì)照組。雖然我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中尿酸治療AD動(dòng)物模型取得了明顯效果，但尿酸應(yīng)用于AD患者還有一段距離，尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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The effects of uric acid on learning-memory ability in the rat model of Alzheimer disease.

SONG Yan，SUO Aiqin，DING Xumeng，WANG Tianhu，YANG Guodong，JIA Lanmei.Department of Neurology，the Second People's Hospitol of Nanyang，Nanyang 473012；Department of Neurology，People’s hospital，Henan Province，Zhengzhou 450014，China.Tel：0377－61609105.

Objective To investigate the effects of uric acid on learning-memory ability in the rat model of Alzheimer disease induced by Aβ1-42.Methods SD rats were divided into blank control group，AD group，uric acid treatment group（group 1－4）（n＝15）.AD animal model was established by injecting Aβ1－42 into the hippocampus；In the first 1－21 day，uric acid group 1，2，3 and 4 were intraperitoneally injected with 1、5、10、20 mg／（kg·d）uric acid，respectively.The blank control group and AD group were intraperitoneally injected with equal dose of saline.All animals were evaluated using Morris water-maze test.Malondialdehyde （MDA） content in＿the hippocampus was measured by using MDA reagent box and Caspase-3-positive neurons in the hippocampus were identified by using immunohistochemistry.Results Compared with the blank control group，the learning-memory ability was significantly declined and MDA content and the expression of Caspase-3-positive cell in the hippocampus was significantly increased at AD group， uric acid group 1，2，3 and 4（P＜0.01）.The improvements in learning-memory，the reduced MDA content and the less caspase-3 expression were observed in rats treated with two doses of uric acid （P＜0.01）.Conclusions Appropriate doses of uric acid can improve the learning-memory ability by reducing the oxidative stress and inhibiting the expression of caspase-3 in the hippocampus in the rat model of Alzheimer disease.

Eyk uric acid Alzheimer disease Learning-memory Malondialdehyde Caspase-3

R742

A

2011－12－10）

（責(zé)任編輯：李 立）

* 河南省南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 （南陽(yáng) 473012）

（E-mail：1136811893＠qq.com）

△ 河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 （鄭州 450014）