腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區(qū)TLR9信號(hào)通路的活化☆

謝芬方建業(yè)潘經(jīng)銳黃小雄王藝東

·論 著·

腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區(qū)TLR9信號(hào)通路的活化☆

謝芬*方建業(yè)*潘經(jīng)銳*黃小雄*王藝東*

目的 觀察大鼠腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區(qū)皮層Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）信號(hào)通路的活化情況。方法 制備Sprague-Dawley（SD）大鼠短暫大腦中動(dòng)脈閉塞模型，缺血90 min后再灌注，隨機(jī)分兩組：6 h組（n＝5）和3 d組（n＝5），分別采用RT-PCR、Western-blot法測(cè)定梗死灶邊緣區(qū)皮層TLR9、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）、干擾素－β（interferon-beta，IFN-β）的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 6 h和3 d組TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表達(dá)量分別為（0.43±0.03）和（0.93±0.03）、（1.21±0.11）和（2.26±0.16）、（0.44±0.04）和（1.27±0.17）、（0.15 ±0.02）和（0.26±0.03），蛋白表達(dá)量分別為（0.75±0.04）和（1.35±0.04）、（0.93±0.04）和（1.05±0.02）、（0.54 ±0.03）和（0.73±0.02）、（0.82±0.02）和（0.93±0.03）（組間比較，均P＜0.01）。同組內(nèi)TNF-α的表達(dá)明顯高于IFN-β的表達(dá)（均P＜0.01）。結(jié)論 TLR9信號(hào)通路在腦梗死早期的炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。

Toll樣受體9 腦缺血再灌注 大鼠

炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷的病理機(jī)制中起著重要的作用，早期造成組織損傷，而后期可能具有內(nèi)源性修復(fù)作用［1］。炎癥反應(yīng)的這種“雙刃劍”作用的機(jī)制是什么還不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分——Toll樣受體 （Toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)了缺血性損傷［2］，其中一個(gè)重要作用就是參與炎癥反應(yīng)。TLR9是Toll樣受體家族的重要成員，定位在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體膜上，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TLR9主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。它不僅可以被來(lái)自病原體的配體激活，而且能被組織損傷后產(chǎn)生的DNA片段激活。TLR9擁有兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，分別經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NFκB（nuclear factor kappa B）或IRF7途徑，誘導(dǎo)促炎因子TNF-α或神經(jīng)保護(hù)分子IFN-β的產(chǎn)生。這兩條通路在腦缺血后不同階段如何發(fā)揮作用還沒(méi)有研究報(bào)道。本研究擬觀察大鼠腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區(qū)皮層TLR9信號(hào)通路的活化情況，初步探討TLR9信號(hào)通路在腦缺血損傷中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇清潔級(jí)健康成年雄性的SD大鼠 20只，體質(zhì)量 280～330 g（由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：NO.0052811），按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（即手術(shù)組）和假手術(shù)組，每組10只。手術(shù)組按再灌注時(shí)間點(diǎn)和腦組織取材來(lái)源再分為：6 h缺血側(cè)（I 1）、6 h缺血對(duì)側(cè)（C 1）、3 d缺血側(cè)（I 2）、3 d缺血對(duì)側(cè)（C 2）四個(gè)亞組。I 1和I 2在梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮層取材，C 1和C 2則在大腦對(duì)側(cè)相應(yīng)皮層取材。相同再灌注時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與缺血對(duì)側(cè)的腦組織取材于同一大鼠，6 h和3 d各5只。假手術(shù)組再分為6 h（S 1）和3 d（S 2）兩個(gè)亞組，各5只，取材部位與I 1、I 2一致。

1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 參照改良Longa氏線栓法［3］制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，在阻塞大腦中動(dòng)脈90 min時(shí)將栓線拔出至頸外動(dòng)脈內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。大鼠清醒后出現(xiàn)左上肢癱瘓、轉(zhuǎn)圈、追尾征等為成功模型。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作同手術(shù)組。術(shù)中及大鼠蘇醒過(guò)程肛溫保持在37℃。

1.3 反轉(zhuǎn)錄酶－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）上述取材的腦組織約100 mg，采用Trizol一步法提取總RNA。采用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物（引物序列見(jiàn)表 1）。RT擴(kuò)增條件：30℃ 10 min，42℃30 min，94℃5 min；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)變性、退火、延伸共35個(gè)循環(huán)，72℃，10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。利用Quantity One（ver 4.6.2）對(duì)所得的電泳圖像作分析。比較目標(biāo)條帶與內(nèi)參的光密度比值。

表1 PCR引物序列

1.4 Western-Blot 按常規(guī)方法提取腦組織總蛋白，SDS-PAGE方法電泳（條件：濃縮膠60 V，45 min，分離膠100 V，120 min），濕法轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜條件：100 V，100 min），封閉后加入一抗稀釋液（TLR9：1∶670，TNF-α：1∶500，IFN-β：1∶250，IRF7：1∶200）過(guò)夜孵育約12～16 h后，再用HRP-羊抗大鼠單抗進(jìn)行二抗孵育。特異性的反應(yīng)條帶通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色。結(jié)果由BIO-RAD圖像分析儀分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 腦缺血再灌注6 h和3 d大鼠梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮層均檢測(cè)到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加（均P＜0.01）。在梗死灶邊緣區(qū)相應(yīng)的對(duì)側(cè)皮層，除TNF-α mRNA外，TLR9、IRF7、IFN-β的mRNA均未檢測(cè)到，但TNF-α mRNA的表達(dá)未隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（P＝0.451）。在同一時(shí)間點(diǎn)，TNF-α mRNA在梗死灶邊緣區(qū)皮層的表達(dá)比對(duì)側(cè)相應(yīng)皮層的表達(dá)更高（均P＜0.01）。同一時(shí)間點(diǎn)比較，梗死灶邊緣區(qū)皮層TNF-α mRNA的表達(dá)明顯高于IFN-β mRNA的表達(dá)（均P＜0.01）。在假手術(shù)組，以上4個(gè)因子的mRNA均未見(jiàn)表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

2.2 Western-Blot 腦缺血再灌注6 h和3 d大鼠腦梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮層均檢測(cè)到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β蛋白的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加（均P＜0.01）。在梗死灶邊緣區(qū)相應(yīng)的對(duì)側(cè)皮層，除蛋白TNF-α外，蛋白TLR9、IRF7、IFN-β均未檢測(cè)到，但蛋白TNF-α的表達(dá)未隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；假手術(shù)組均未見(jiàn)上述蛋白的表達(dá)。同一時(shí)間點(diǎn)比較，梗死灶邊緣區(qū)和對(duì)側(cè)皮層的TNF-α蛋白表達(dá)均明顯高于IFN-β蛋白表達(dá)（均P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

3 討論

TLRs是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在先天性和獲得性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中起著重要作用。TLRs的一個(gè)重要作用就是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的TLRs主要是TLR2、TLR4和TLR9。既往研究已證實(shí)TLR2和TLR4在腦缺血損傷中發(fā)揮作用［4］。而TLR9如何起作用還不清楚。TLR9信號(hào)通路具有TLR9-NFκB-TNF-α和TLR9-IRF7-IFN-β兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路。本實(shí)驗(yàn)利用腦缺血再灌注的大鼠模型，觀察到腦缺血再灌注早期（6 h、3 d）TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白表達(dá)水平在缺血側(cè)皮層均有明顯升高，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加更加明顯。表明腦缺血再灌注后TLR9的兩條信號(hào)通路均被激活，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加。

本研究還發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注6 h和3 d，TNF-α的表達(dá)量明顯高于IFN-β，提示TLR9-NFκB-TNF-α通路的激活較 TLR9-IRF7-IFN-β通路的激活更強(qiáng)，這與腦缺血再灌注早期炎癥反應(yīng)造成組織損傷的研究結(jié)果一致。既往研究顯示，TNF-α是急性腦缺血損傷后重要的炎癥因子。TNF-α能刺激組織因子和白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞介素－1、一氧化氮、血管性血友病第八因子、血小板激活因子和內(nèi)皮素的釋放，抑制凝血酶調(diào)節(jié)素－蛋白C－蛋白S系統(tǒng)的活性，減少組織纖溶酶原激活物的產(chǎn)生，從而減少纖溶酶原激活物抑制劑－1的釋放。TNF-α還能通過(guò)誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶，環(huán)氧合酶和煙酰胺腺嘌呤磷酸氫二核苷酸氧化酶以及其他相關(guān)的酶活性刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧化物。以上這些效應(yīng)刺激局部腦血管，使局部腦血管易于形成炎癥、血栓和發(fā)生出血，從而促進(jìn)缺血性腦卒中的發(fā)生和進(jìn)展［5－6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，IFN-β不僅具有抗病毒效應(yīng)，在抗炎癥方面也發(fā)揮積極的作用。在細(xì)胞水平，IFN-β被證明能減少活性氧化物［7］，抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)物和誘導(dǎo)由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促神經(jīng)生長(zhǎng)因子產(chǎn)物——白細(xì)胞介素－1受體拮抗劑［8］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-β在缺血組織中的表達(dá)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，因此推測(cè)，IFN-β可能在腦缺血再灌注后期發(fā)揮作用，值得進(jìn)一步研究。

圖1 大鼠頂葉皮層TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的mRNA表達(dá)。其中I 1、I 2、C 1、C 2、S 1、S 2分別代表：6 h缺血側(cè)，3 d缺血側(cè)，6 h缺血對(duì)側(cè)，3 d缺血對(duì)側(cè)，假手術(shù)6 h，假手術(shù)3 d

圖2 大鼠頂葉皮層TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的蛋白表達(dá)

表2 大鼠頂葉皮層TLR9信號(hào)分子mRNA表達(dá)

表3 大鼠頂葉皮層TLR9信號(hào)分子蛋白表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)在缺血對(duì)側(cè)的皮層中，TNF-α mRNA和蛋白均有表達(dá)，但沒(méi)有隨時(shí)間的變化而變化，表達(dá)量也明顯少于缺血側(cè)。Sairanen等［9］的研究也發(fā)現(xiàn)，梗死灶中心和邊緣區(qū)TNF-α的表達(dá)升高，而在對(duì)側(cè)腦組織和其他遠(yuǎn)隔部位也能觀察到TNF-α的表達(dá)，但表達(dá)的量要低于梗死側(cè)。本實(shí)驗(yàn)在缺血對(duì)側(cè)的皮層中，未觀察到TLR9、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白的表達(dá)，說(shuō)明缺血對(duì)側(cè)的TNF-α表達(dá)可能與TLR9的激活無(wú)關(guān)，是什么原因所致，還需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本研究觀察到，在腦缺血再灌注早期，TLR9的兩條信號(hào)通路均被激活，分別產(chǎn)生了促炎因子TNF-α和神經(jīng)保護(hù)分子IFN-β，而TNF-α的表達(dá)明顯強(qiáng)于IFN-β。提示TLR9信號(hào)通路在腦梗死早期的炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。

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The activation of TLR9 signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of cerebral ischemiareperfusion.

XIE Fen，F(xiàn)ANG Jianye，PAN Jingrui，HUANG Xiaoxiong，WANG Yidong.Department of Neurology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Tel：020－81332619.

Objective To study the activation of toll-like receptor 9（TLR9）signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of ischemia-reperfusion in a rat model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Methods The MCAO model was induced in male rats by using intraluminal filament technique and reperfusion was performed by removing the filament at 90 minutes after occlusion.The MCAO rats were randomly assigned to 2 groups：6 h group（n＝5）and 3d group（n＝5）.RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of TLR9， TNF-α， IRF7 and IFN-β in the peri-infarct cortex.Results The mRNA and protein expression of TLR9，TNF-α，IRF7 and IFN-β were significantly higher in the 3 d group than in the 6 h group（mRNA：0.93±0.03 vs.0.43 ±0.03 on TLR9，2.26±0.16 vs.1.21±0.11 on TNF-α，1.27±0.17 vs.0.44±0.04 on IRF7，0.26±0.03 vs.0.15± 0.02 on IFN-β；protein：1.35±0.04 vs.0.75±0.04 on TLR9，1.05±0.02 vs.0.93±0.04 on TNF-α，0.73±0.02 vs.0.54±0.03 on IRF7，0.93±0.03 vs.0.82±0.02 on IFN-β；P＜0.01）.The mRNA and protein expression of TNF-α were significantly higher than IFN-β in the peri-infarct cortex at all time points（P＜0.01）.Conclusions TLR9 signaling pathway may play a critical role in the inflammatory response at the early stage of cerebral infarction.

Toll-like receptor 9 Cerebral ischemia-reperfusion Rat

R741

A

2011－05－06）

（責(zé)任編輯：李 立）

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81171103），廣東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：9151008901000028，S2011010006043）

* 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)科（廣州 510120）

（E-mail：wydys＠yahoo.com.cn）