多波長(zhǎng)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定抗菌消炎膠囊中3種有效成分的含量

黃 銘 黃冬梅 彭莉云

1.廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545001;2.廣西中醫(yī)學(xué)院賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001

抗菌消炎膠囊為收載于部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)第七冊(cè)［1］的抗菌消炎片改變劑型品種，由金銀花、百部、黃芩、大黃、大青葉、知母、金錢草等7味中藥組成，具有清熱、瀉火、解毒的功效。

原片劑標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)組方中任何有效成分進(jìn)行定性、定量監(jiān)控，在《中國(guó)藥典》(2010年版)中并未收入有關(guān)抗菌消炎膠囊含量測(cè)定的方法和標(biāo)準(zhǔn)。方中金銀花清熱解毒，涼散風(fēng)熱，其有效成分為綠原酸;黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血，其有效成分為黃芩苷、黃芩素;大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、活血祛瘀，其有效成分為大黃酚、大黃素、大黃酸等。該制劑已有一些文獻(xiàn)對(duì)抗菌消炎片的藥效學(xué)、薄層色譜、某些成分含量測(cè)定方面作了研究報(bào)道［2－10］。本實(shí)驗(yàn)采用多波長(zhǎng)高效液相色譜 (HPLC)法同時(shí)測(cè)定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷和大黃酚的含量，以控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent LC－1100高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、1260二極管陣列檢測(cè)器。色譜柱為VPODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm)，島津AE200電子分析天平。

1.2 試藥 對(duì)照品綠原酸 (0753－200111)、黃芩苷(110715－200514)和大黃酚 (0796－200005)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純、磷酸為分析純，水為一級(jí)純化水。

抗菌消炎膠囊為廣西柳州某藥廠提供，陰性樣品按抗菌消炎膠囊處方比例配置。

2 方法和結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品綠原酸、黃芩苷和大黃酚適量，精密稱定，置同一20ml量瓶，用70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品備用溶液。精密吸取上述混合對(duì)照品備用溶液，稀釋成濃度分別為綠原酸10.58μg/ml、 21.16μg/ml、 42.32μg/ml、 105.8μg/ml 、211.6μg/ml 、 317.4μg/ml ; 黃 芩 苷 15.77μg/ml、31.54μg/ml、 63.08μg/ml、 157.7μg/ml、 315.4μg/ml、473.1μg/ml;大黃酚 0.5043μg/ml、1.009μg/ml、2.017μg/ml、5.043μg/ml、10.09μg/ml、15.13μg/ml的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取抗菌消炎片20片，去除包衣用研缽碾成細(xì)粉，精密稱取上述粉末0.30g，置50ml具塞錐形瓶中，稱定重量，加70%甲醇20ml超聲處理30min，靜置至室溫，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱:VP－ODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相:A相為0.1%磷酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫 (0～20min:85% →55%A，15% →45%B;20～40min:55%A，45%B;41～42min:55%→85%A，45%→15%A);流速:1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm(0～20mim，檢測(cè)綠原酸)、372nm(20～30nim，檢測(cè)黃芩苷)、254nm(30～40nim，檢測(cè)黃芩苷);柱溫:30℃;進(jìn)樣量為 10μl。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性 陰性樣品在綠原酸、黃芩苷和大黃酚的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好，且在40min內(nèi)基線分離且空白無干擾?？瞻住?duì)照品以及樣品的色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 分別將配置的系列對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液的濃度 (X，μg/ml)對(duì)峰面積 (Y)進(jìn)行線性回歸。綠原酸、黃芩苷和大黃酚的回歸方程分別為:Y=10.35X－5.354，r=0.9999;Y=9.753X－1.768，r=0.9988;Y=13.43X－2.876，r=0.9996。線性范圍:綠原酸10.58 ～317.4μg/ml，黃芩苷15.77 ～473.1μg/ml，大黃酚0.5043 ～15.13μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積RSD(n=5)結(jié)果分別為:綠原酸0.65%，黃芩苷0.48%，大黃酚0.77%。表明該方法的精密度良好。

2.7 檢測(cè)限 將綠原酸、黃芩苷、大黃酚對(duì)照品溶液分別進(jìn)行稀釋，以信噪比為3∶1時(shí)，確定其最低檢測(cè)限分別為0.321μg/ml、0.210μg/ml、0.044μg/ml。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取制備的供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、16、24h測(cè)定綠原酸、黃芩苷、大黃酚的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD分別為1.0%、1.3%、1.9%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品5份，分別按供試品測(cè)試條件測(cè)定綠原酸、黃芩苷、大黃酚的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為0.73%;黃芩苷RSD為0.87%;大黃酚RSD為1.80%;結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批已知含量的供試品0.15g共9份，按低、中、高濃度分別精密加入綠原酸、黃芩苷、大黃酚對(duì)照品溶液一定的量 (樣品含量的80%、100%、120%)，每一濃度平行制備3份，照供試品測(cè)定項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸、黃芩苷、大黃酚的回收率分別為:99.5%(RSD=0.8%，n=3);98.9%(RSD=1.1%，n=3);98.3%(RSD=1.8%，n=3)。結(jié)果表明，采用本方法測(cè)定抗菌消炎膠囊中綠原酸、黃芩苷、大黃酚的含量，加樣回收率良好。

2.11 樣品測(cè)定 照供試品測(cè)定項(xiàng)下操作制備供試品溶液3份，測(cè)定峰面積，將所得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算綠原酸、黃芩苷、大黃酚的平均含量，分別為8.30mg/g(RSD=0.45%)、20.33mg/g(RSD=0.78%)、0.11mg/g(RSD=1.9%)。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取對(duì)照品溶液，在200nm～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在280nm波長(zhǎng)處黃芩苷有最大吸收，372nm波長(zhǎng)處綠原酸有最大吸收，254nm波長(zhǎng)處大黃酚有最大吸收。在實(shí)驗(yàn)中曾選擇280nm波長(zhǎng)下同時(shí)檢測(cè)3個(gè)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低了綠原酸和大黃酚的檢測(cè)靈敏度。故采用多波長(zhǎng)分別在各個(gè)被測(cè)成分紫外最大吸收波長(zhǎng)處同時(shí)進(jìn)行含量檢測(cè)。即提高了檢測(cè)靈敏度，又保障測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.2 樣品前處理方法的選擇 在采用相同溶劑的條件下，超聲提取效率和回流提取效率相當(dāng)，由于回流法過程煩瑣，易造成損失而且綠原酸受熱不穩(wěn)定不宜熱提［7］，且考慮到超聲提取操作步驟簡(jiǎn)便，于是選用超聲法。溶劑種類考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇;溶劑體積考察了15、20、30ml;超聲時(shí)間考察了15、30、45min。結(jié)果以20ml、70%甲醇提取30min效果較好。所以樣品采用70%甲醇20ml超聲提取30min作為前處理?xiàng)l件。

3.3 液相條件的選擇

3.2.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)嘗試了0.1%磷酸水溶液－甲醇、0.2%磷酸水溶液－甲醇、0.1%磷酸水溶液－乙腈等多種流動(dòng)相系統(tǒng)。經(jīng)過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以甲醇－0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系，不僅3種成分的峰型良好且與雜質(zhì)峰的分離度均能達(dá)到要求，故最終選用0.1%磷酸水溶液－甲醇作為流動(dòng)相。

3.3.2 洗脫條件的摸索 選擇合適的洗脫條件對(duì)樣品的有效分離起著關(guān)鍵的作用。本制劑為中成藥，成分較復(fù)雜，且3種成分極性差異大，采用等度洗脫難以達(dá)到分離效果。通過考察不同梯度配比的流動(dòng)相，最終確定本方法采用的梯度洗脫的方法，可將被測(cè)成分與其他雜質(zhì)峰有效分離，色譜基線平穩(wěn)，分離度、拖尾因子等色譜參數(shù)都能達(dá)到要求。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.中藥成方制劑.第七冊(cè)，1993:75.

［2］黃俊.抗菌消炎片的抗菌抗炎實(shí)驗(yàn)研究［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，7(1):39－42.

［3］趙小霞，張丁丁.抗菌消炎片的薄層研究［J］.中醫(yī)藥信息，2002，19(4):68－70.

［4］潘馨.高效液相色譜法測(cè)定銀黃膠囊中綠原酸及黃芩苷的含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2003，20:493－495.

［5］馬駿，陳凌，任遠(yuǎn)，王志旺，吳國(guó)泰.抗菌消炎片主要藥效學(xué)研究［J］.中成藥，2005，06:22.

［6］車慶明，薛彬彬，陳穎.高效液相色譜法測(cè)定雙黃連制劑中黃芩苷和黃芩素的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27:211－213.

［7］史克莉，許蠟英.不同提取方法對(duì)金銀花中綠原酸含量測(cè)定的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25:820－821.

［8］抗菌消炎片中綠原酸的含量測(cè)定［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(9):797－798.

［9］高效液相色譜法測(cè)定抗菌消炎片綠原酸、黃芩苷、黃芩素和大黃酚的含量［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(10):1191－1194.

［10］HLPC法測(cè)定抗菌消炎片中黃芩苷的含量［J］.齊魯藥事，2010，29:08.