VB12檢測技術(shù)研究進(jìn)展*

崔明，楊大進(jìn)，魯杰，王竹天

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京，100021)

VB12檢測技術(shù)研究進(jìn)展*

崔明，楊大進(jìn)，魯杰，王竹天

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京，100021)

VB12是一種水溶性維生素，在食品中含量極低，特別是由于動物食品組分更為復(fù)雜等因素，使其檢測異常困難。文中從樣品水解提取技術(shù)、固相萃取凈化技術(shù)、VB12的轉(zhuǎn)化技術(shù)、檢測技術(shù)等方面對國內(nèi)外文獻(xiàn)中VB12的分析方法進(jìn)行綜述。

食品;富集凈化;維生素B12;檢測技術(shù);綜述

VB12［1］又稱鈷胺素(cobalamins)，是一組由鈷結(jié)合咕啉環(huán)的紅色類咕啉化合物的總稱。其作為維持人體正常代謝和機(jī)能不可缺少的一種微量營養(yǎng)素［2］，主要生理功能已基本明確［3］。VB12對人體健康的影響主要為缺乏所致，現(xiàn)已成為繼葉酸之后全球微營養(yǎng)素和疾病預(yù)防領(lǐng)域中關(guān)注的又一新的熱點(diǎn)。VB12多存在于富含高蛋白、高脂肪的動物食品中，以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種形式存在，其中以結(jié)合態(tài)存在的VB12又分為兩類，一類是結(jié)合咕啉蛋白，另一類是中間絲狀蛋白 IF(intermediate filament)［4－5］。VB12的檢測至今是國際上食品分析的難題之一，首先是動物食品中的VB12有多種結(jié)構(gòu)形式，如羥鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素、氰基鈷胺素等，傳統(tǒng)的分析方法很難反映其實(shí)際含量;其次VB12在食品中的含量低，迄今檢測最高含量的牛肝為60μg/100g，通常食品含量在0.4 ～3μg/100g;再者，VB12主要以 VB12-內(nèi)因子復(fù)合物的形式存在，充分提取和分離難度很大;另外，樣品中其他色譜行為與VB12相近的水溶性維生素也會對它的分離檢測造成很大干擾。本文從樣品檢測技術(shù)、水解提取技術(shù)、固相萃取凈化技術(shù)、VB12的轉(zhuǎn)化技術(shù)、等方面對國內(nèi)外文獻(xiàn)中VB12的分析方法的研究進(jìn)展情況進(jìn)行了概括總結(jié)，為動物性食品中VB12的分析研究提供必要參考。

1 VB12檢測方法

VB12經(jīng)典的分析方法為微生物法隨著現(xiàn)代儀器靈敏度和選擇性的提高，使得建立快速、操作簡便的化學(xué)測定法成為可能。

1.1 微生物測定法

微生物測定法［7］是依靠萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii)等菌種在一定的條件下，生長與繁殖和VB12的含量成線性關(guān)系的原理，通過測定濁度或光密度來確定細(xì)菌生長和繁殖的強(qiáng)度，從而間接地測定食物樣品中VB12的含量，是一種半定量方法。目前GB 5413.14－2010(嬰幼兒食品和乳品中VB12的測定)和AOAC法均采用此法。Fumio Watanabe等［8］用微生物測定法對豬肝等食品中VB12進(jìn)行檢測，檢測限為 0.01 μg/L。Esteve 等［9］用該法對生鮮豬肉中VB12進(jìn)行測定，測得鮮豬肉中VB12含量在0.41～1.11 μg/100 g。該法雖然具有靈敏度較高的特點(diǎn)［8，10－13］，但是由于試驗(yàn)耗時(shí)長，操作復(fù)雜，重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，有被化學(xué)法替代的趨勢。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［14］作為含量測定的一種粗篩方法，可用于食品中VB12的檢測。Reichert等人［15］用競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法(CPBA)使氰鈷胺素共軛結(jié)合在聚苯乙烯ELISA測試板上，讓R蛋白與氰鈷胺素結(jié)合，檢測限達(dá)135～262 pg/kg，回收率82.1% ～103.3%。Sharma 等［16］使用 ELISA 對乳品中的VB12進(jìn)行了測定，對牛乳，羊乳的中的檢測限可達(dá)3.91μg/kg。ELISA方法雖然具有后期分離時(shí)保持物質(zhì)原始活性的特點(diǎn)，但由于成本較高、適用范圍狹窄、存在假陽性等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到一定的限制。

1.3 薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)

有學(xué)者采用薄層色譜法(TLC)［17］對富含VB12的樣品進(jìn)行測定，其原理是利用VB12與雜質(zhì)組分在薄層上展開速度的差異而進(jìn)行分離、凈化、測定。Tanioka等［18］使用silica gel 60 TLC 配合E.coli 215大腸桿菌生物自顯影法對食品中的VB12進(jìn)行了測定。方法的檢測限為0.10 g/100 g，定量限為0.30 g/100 g。從Tanioka等人的研究不難看出，TLC法檢測限過高，不適合動物性食品中低含量的VB12測定。

1.4 原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrophotometry，AAS)

原子吸收分光光度法［19］是利用鈷原子的特征吸收與經(jīng)過消化處理的VB12中的鈷原子含量成正比關(guān)系，從而達(dá)到間接測定樣品中的 VB12含量的目的。Sagaya等［6］使用火焰原子吸收分光光度計(jì)，將VB12膠囊，VB12注射液在尿素、過氧化氫的堿性環(huán)境下進(jìn)行消解，得到游離的鈷元素，從而間接計(jì)算出VB12的含量，方法的檢測限5 pg/mL，線性范圍10pg/mL～1μg/mL，回歸系數(shù)0.999 8，回收率在97% ～99.2%。該方法雖然有較高的靈敏度，但是由于無法去除樣品基質(zhì)中其他鈷元素本底的引入，使測定結(jié)果往往高于樣品中VB12的含量值。

1.5 化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence，CL)

化學(xué)發(fā)光法［8］是近年來發(fā)展起來的另一種測定VB12的高靈敏分析方法。Fumio Watanabe 等人［8］使用化學(xué)發(fā)光法對海藻保健食品中的VB12進(jìn)行了測定:經(jīng)過前處理后VB12直接進(jìn)入全自動化學(xué)發(fā)光檢測器進(jìn)行監(jiān)測，檢測限在0.05 μg/L、變異系數(shù)1.2% ～6.7%?；瘜W(xué)發(fā)光法由于其特異性可以用于鑒別海藻保健品中的 VB12和 VB12的類似物［20］，但由于需購置特定的儀器設(shè)備——化學(xué)發(fā)光儀，使得方法的普及和推廣受到限制。

1.6 高效液相色譜-紫外法 (high performance Liquid chromatography-UV，HPLC-UV)

高效液相色譜法-紫外法(HPLC-UV)［21］隨著儀器普及率的不斷提高以及檢測技術(shù)推廣的需要，越來越成為VB12分析工作者重點(diǎn)研究的方向。Jonh Dalabacke等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)，VB12在水溶液中的3個(gè)吸收波長分別是278、361、550 nm。Mussie等［23］使用反相C18柱(150 mm ×4.6 mm，5μm)和紫外檢測器對海水中VB12進(jìn)行測定，方法的檢測限在0.042 ng/L，回收率92% ～99%。Marley等［10］對功能性飲料、啤酒、小麥類早餐制品、碳酸飲料中的VB12進(jìn)行了測定，檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8% ～10%之間，檢測限0.44 μg/100g。Campos-Gimenez 等［13］使用免疫親和柱配合HPLC對牛乳大豆嬰兒配方食品中的VB12進(jìn)行了測定，檢測限和定量限分別為0.10、0.30μg/100 g，回收率為93.3% ～108.3%。高效液相色譜-紫外法相對于微生物法具有快速、分離完全、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，漸漸成為廣大VB12分析工作者重點(diǎn)研究的方向。

1.7 高效液相色譜-熒光光度法(high-performance liquid chromatography-fluorescence spectrophotometry，HPLC-FS)

高效液相色譜-熒光光度法［24］主要是使用特定的衍生試劑將本身不具有熒光的VB12進(jìn)行衍生處理，得到的衍生產(chǎn)物具有熒光而達(dá)到間接測定的一種分析方法。Li等［25］使用275 nm作為激發(fā)波長，305 nm作為發(fā)射波長，對嬰兒配方乳制品的VB12進(jìn)行了檢測，研究發(fā)現(xiàn)用熒光光度法測定VB12時(shí)，pH=7.0是最佳酸堿度，該方法檢出限為0.1μg/L。Pakin等［11］把豬肝中得到的 VB12轉(zhuǎn)化成α-Ribazole形式，使用250 nm作為激發(fā)波長，312 nm作為發(fā)射波長對其進(jìn)行檢測，方法的定量限在3 ng/g。Fumio Watanabe等［26］使用DMEQ(喹喔啉酮)對牛肉、豬肉、牛奶中的VB12進(jìn)行衍生，使用365 nm作為發(fā)射波長，447 nm作為激發(fā)波長，配合熒光分光光度計(jì)，測得牛乳的VB12檢測限在0.2～10μg/L。熒光光度法與紫外可見分光光度法相比，前者對VB12擁有更好的選擇性和靈敏度，并且具有使用試樣少，線性范圍寬等特點(diǎn)，但是熒光光度法易受溶劑極性、內(nèi)部所含重金屬原子和溫度的影響造成熒光淬滅等現(xiàn)象。

1.8 質(zhì)譜法(mass Spectrometry，MS)

質(zhì)譜法(MS)［27］是是利用離子化技術(shù)，將各種構(gòu)型的VB12分別電離成相應(yīng)的離子，然后依據(jù)質(zhì)荷比的差異而達(dá)到構(gòu)型分離的一種高靈敏的分析方法。Luo等［12］曾經(jīng)用 HPLC-ESI-MS方法對 VB12進(jìn)行測量，回收率在 93% 以上。Koyyalamudi等［28］也使用了HPLC-ESI-MS方法測定白頂蘑菇中 VB12的含量。Chen等［29］也用了CE-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)對海藻制品的VB12進(jìn)行分析，氰鈷胺素，羥鈷胺素的檢測限分別是0.3 ng/mL 和 0.2 μg/mL。Baker 等［30］使用 CEICP-MS法對多種鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了測定，在電泳電壓30 kV下，檢測限50 ng/mL，Hubert Chassaigne等［31］在研究中使用了電噴霧離子源(IS-MS)和ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，取得了10 ng/mL的檢測靈敏度。與HPLC-UV法相比，質(zhì)譜法擁有著更高的靈敏度和更低的檢測限。但由于HPLC-MS儀器價(jià)格昂貴、運(yùn)行費(fèi)用較高，很少在VB12的測定中廣泛使用。

2 樣品前處理方法

樣品前處理指樣品的制備及對待測組分進(jìn)行提取、凈化、濃縮，以及將被測組分轉(zhuǎn)變成可測定的形式后進(jìn)行定量、定性分析的實(shí)驗(yàn)過程。樣品前處理的目的是消除基體干擾，提高方法的準(zhǔn)確度、精密度、選擇性和靈敏度。前處理手段不當(dāng)會出現(xiàn)組分損失、干擾組分不能完全除去或引入雜質(zhì)等問題。因此，樣品前處理是分析檢測過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只要檢測儀器穩(wěn)定可靠，檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性就主要取決于樣品前處理。VB12的前處理包括凈化、富集、對VB12進(jìn)行衍生等技術(shù)。

2.1 VB12提取

目前針對動物性食品中VB12的提取多采用酶水解、酸水解、微波消解、透析等方法。

2.1.1 酶水解提取法

酶水解是利用酶的生物催化作用水解樣品的一種方法。通過酶解手段釋放與蛋白結(jié)合的VB12，從而為獲得游離VB12與結(jié)合型VB12的總量提供基礎(chǔ)。目前國際上主要使用胃蛋白酶對動物樣品進(jìn)行水解以實(shí)現(xiàn)對VB12的測定。Pakin等人［11］用胃蛋白酶水解結(jié)合反相液相色譜對VB12進(jìn)行測定，在pH=4的醋酸緩沖溶液中對豬肝、雞蛋、牛肉，鮮鮭魚、鮮鯖魚等樣品進(jìn)行酶解，使得結(jié)合態(tài)VB12與蛋白質(zhì)得以分離。該方法有良好的回收率(95% ～100%)和較好的重現(xiàn)性(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.0% ～5.4%)。Luo等人［12］在分析乳制品中VB12時(shí)加入淀粉酶和胃蛋白酶，方法的回收率達(dá)到了93%，檢測限為2 ng/g。Bj?rn Liaset等人［32］使用復(fù)合蛋白酶對鮭魚樣品進(jìn)行水解，VB12在鱈魚中的含量為0.11 mg/kg，在三文魚中的含量為0.11 mg/kg。表明酶水解法適合于處理高蛋白和高脂肪基質(zhì)的動物樣品，方法處理?xiàng)l件溫和，是目前分析動物制品中VB12使用最常見的提取方法。

2.1.2 酸水解提取法

酸水解法是利用酸的消化作用對樣品基質(zhì)進(jìn)行分解，使 VB12離解的一種方法。Anna Lebiedzinskat等［4］將三文魚、牡蠣、豬肝等樣品在 121℃ 時(shí)用0.055 mol/L的鹽酸對其進(jìn)行水解，處理時(shí)間4h，方法的回收率為96.5%，且測定VB12的同時(shí)可測定其他B族維生素。該方法相對于酶水解而言，具有諸如加熱溫度高，加熱時(shí)間長等不利之處。

2.1.3 微波消解法

微波消解法是利用極性分子在高頻交變電場中高速震蕩引起振動產(chǎn)生的熱能，從而使樣品快速、有效的釋放出VB12的一種提取方式。微波消解法與酸水解方法相比具有高速、簡便的特性，由于不加入其他化學(xué)助劑，微波消解法同時(shí)也具有空白值低的特點(diǎn)。Chen等［8］將樣品凍干粉碎后，采用微波消解法對其中VB12進(jìn)行提取，微波功率設(shè)置為600 W，壓力689 kPa時(shí)，最終回收率在95% ～106%。但也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在沒有CN－的衍生保護(hù)時(shí)，使用微波加熱法對樣品進(jìn)行處理會導(dǎo)致部分VB12的 降解:Fumio Watanabe等［5］使用600 W 2 450 MHz的微波下對豬肉，牛乳，牛肉進(jìn)行了加熱，時(shí)間6 min，在沒有CN－的衍生化保護(hù)時(shí)微波對樣品中羥基鈷胺素的損失將達(dá)到30% ～40%。Fumio Watanabe等［33］在中性環(huán)境下使用500 W、2 450 MHz的微波單獨(dú)對羥鈷銨素標(biāo)準(zhǔn)溶液加熱，時(shí)間為6 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羥基鈷胺素產(chǎn)生了降解，損失率達(dá)45%。故針對VB12微波消解法尚是一種值得商榷的前處理方法。

2.2 維生素VB12的富集凈化

由于動物性食品中基質(zhì)復(fù)雜，在提取過程中會同時(shí)提取出很多干擾組分，這些干擾組分會在后期的儀器分析中對目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定性、定量造成極大的影響。針對VB12的分析瓶頸也主要集中在該步驟，采用何種富集凈化技術(shù)達(dá)到對痕量VB12的富集以及如何去除大量干擾雜質(zhì)是研究的方向。

2.2.1 樹脂吸附法

樹脂吸附法是依靠樹脂對樣液中VB12的選擇性吸附而進(jìn)行富集凈化的一種方法。Mussie等［23］對海水中VB12含量進(jìn)行分析時(shí)將C18樹脂裝填于聚丙烯管中作為樣品的富集凈化手段，并配合HPLC-UV進(jìn)行監(jiān)測。方法的檢測限為0.042 ng/L，線性范圍為0.1～6μg/mL，回收率為92% ～99%。王重等［34］使用了酚醛型吸附樹脂對VB12溶液進(jìn)行吸附，發(fā)現(xiàn)該樹脂對VB12吸附量可達(dá)到84μg/g。樹脂吸附法雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，但對分離試樣中雜質(zhì)的含量要求較為嚴(yán)格，如提取液中雜質(zhì)含量過高，可能導(dǎo)致吸附法效率下降等問題，使其應(yīng)用受到一定的限制。

2.2.2 透析法

透析法是一種利用滲透和對流作用使VB12從半透膜的一側(cè)移動到膜的另一側(cè)，從而達(dá)到與樣品提取液中雜質(zhì)分離。透析法利用透析的特性，可以阻擋酶和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)透過。Gustavo Medina-Alonso等［35］分別對脫脂奶、全脂奶、無乳糖奶、奶粉、煉乳等樣品中的VB12含量進(jìn)行測定，并配合使用高效液相色譜法，檢測限可達(dá)到0.01 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%。這種提取方法雖然具有常溫提取、無熱損失的優(yōu)點(diǎn)，但是由于存在耗時(shí)長，提取不完全、適用范圍窄等缺陷而很少被使用和推廣。

2.2.3 固相萃取柱法

固相萃取法是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種樣品富集凈化手段，主要基于液-固相色譜法原理，采用不同填料床材料，對樣品進(jìn)行快速的富集、凈化、分離［1］。Fang等［36］使用纖維管固相萃取技術(shù)對運(yùn)動型飲料中的VB12進(jìn)行了富集，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.5% ～4.3%，回收率為 92.4% ～99.2%。Jonh Dalbacke等［37］在分析復(fù)合維生素片所含VB12時(shí)使用了固相萃取技術(shù)，回收率達(dá)91% ～95%。Iwase Hiroshi等人［38］通過膜分離法配合固相萃取法對富含油脂的食品中的VB12進(jìn)行了分析，結(jié)果線性范圍0.1～3 ng/g，回收率高于90%，固相萃取法具有操作簡、高效、可靠、消耗試劑小等優(yōu)點(diǎn)。自出現(xiàn)以來迅速發(fā)展。作為一種前處理方法，固相萃取法在許多領(lǐng)域上取代了傳統(tǒng)萃取方式。

2.2.4 免疫親和法

免疫親和法是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合特性的固相萃取技術(shù)，根據(jù)抗原抗體的高選擇性，從復(fù)雜的待測樣品中提取目標(biāo)化合物，是一種新型分離富集以及凈化待測VB12的方法。樣品經(jīng)過酶解和氰鈷銨素構(gòu)型轉(zhuǎn)化后，提取液可直接使用免疫親和柱進(jìn)行富集。Pakin等［11］使用免疫親和柱進(jìn)行樣品的富集，洗脫液經(jīng)氮吹濃縮，轉(zhuǎn)化后樣品定量限可到3 ng/g，樣品的回收率為98%。Heudi等［39］使用免疫親和柱對奶粉中VB12進(jìn)行測定，定量限為2.5 ng/g，回收率為94% ～100%。Marley等［10］的研究中使用了 EASI-EXTRA免疫親和柱對功能性飲料等樣品進(jìn)行提取分析，配合HPLC-UV檢測，取得了較好的重現(xiàn)性，檢測限0.44μg/100g，變異系數(shù)在 0.8% ～10%之間。免疫親和法由于其自身特性，適合對高雜質(zhì)、低含量樣品中的VB12進(jìn)行分析。但是免疫親合法具有價(jià)格不菲，處理樣品量少、免疫親和柱保存條件苛刻的缺點(diǎn)。

2.3 VB12構(gòu)型轉(zhuǎn)化法

針對樣品提取液中的VB12含微小的問題，在儀器分析過程中可以將其熒光衍生或者使其轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)，由此提高該物質(zhì)對于檢測系統(tǒng)的響應(yīng)，通常采用熒光衍生化和使其他形式的鈷胺素轉(zhuǎn)化成氰鈷胺素的方法進(jìn)行處理，使其達(dá)到分析的靈敏度。

2.3.1 α-ribazole衍生化法

α-ribazole衍生能夠使VB12具有熒光性質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是能使方法的特異性增強(qiáng)、信號強(qiáng)度提升、靈敏度增強(qiáng)。Pakin等［11］對豬肝樣品中的VB12進(jìn)行 α-ribazole衍生化和堿性磷酸酶處理，使反應(yīng)物具有熒光性質(zhì)，測定用激發(fā)波長為250 nm，發(fā)射波長為312 nm，可進(jìn)行HPLC-熒光色譜分析。方法回收率為95%，定量限3 ng/g。

2.3.2 氰化衍生法

構(gòu)型轉(zhuǎn)化的目的是讓不同構(gòu)型的VB12在KCN環(huán)境中衍生化成為氰鈷銨素的形式，通過該衍生反應(yīng)可以使不穩(wěn)定的各類鈷胺素轉(zhuǎn)化成相對穩(wěn)定的氰鈷胺素［40－42］，為后期檢測 VB12的總量提供有利條件。Fumio Watanabe等人［8］對貝類中 VB12使用了氰鈷胺素轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行分析，將貝類勻漿后和1%KCN一起煮沸處理進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后配合化學(xué)發(fā)光VB12檢測法，方法的線性相關(guān)系數(shù) r=0.99，變異系數(shù)為1.2% ～6.7%。這種轉(zhuǎn)化法提高了VB12的熱穩(wěn)定性，也有利于反映出樣品中VB12的真實(shí)含量。

3 展望

隨著科學(xué)的發(fā)展，從VB12被發(fā)現(xiàn)至今，對其提取、分析等檢測技術(shù)方面取得了很大進(jìn)步。檢測VB12的關(guān)鍵在于樣品的前處理階段:選用條件溫和的酶水解法促進(jìn)樣品中VB12的釋放，富集凈化時(shí)可以利用固相萃取柱或免疫親和柱的高度特異性吸附對VB12快速簡便地富集，并根據(jù)固相萃取的類型，對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。在儀器分析階段，可以使用高效而且定量準(zhǔn)確的HPLC-UV進(jìn)行分析。隨著精密儀器制造技術(shù)的發(fā)展和高分子科學(xué)的進(jìn)步，VB12的分析已經(jīng)開始從微生物方法逐漸向儀器分析方法轉(zhuǎn)變，隨著前處理的手段不斷進(jìn)步完善，更多儀器分析方法和凈化方法將會突破檢測中VB12本底值低、樣品雜質(zhì)干擾大的瓶頸，使VB12的分析更加高效、準(zhǔn)確。

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Progress on the Determination of Vitamin B12

Cui Ming，Yang Da-jin，Lu Jie，Wang Zhu-tian
Institute for Nutrition and Food Safty，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021，China

Vitamin B12is a kind of water soluble vitamins.The amount of vitamin B12in food holds very low level and it is hard to measure because of the complexity of animal food.Analytical techniques were reviewed in the paper such as sample hydrolyzation，solid phase extraxtion，configuration transformation，as well as the focus on the detection method of Vitamin B12based on the study of vitamin B12at home and abroad.

food，enrichment and purification，vitamin B12，detecting method，review

碩士研究生(王竹天研究員、楊大進(jìn)研究員為通訊作者)

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目

2010－10－18，改回日期:2011－03－11