實(shí)時(shí)熒光定量PCR在植物害蟲研究中的應(yīng)用

郭慶，王忠躍，孔繁芳，武艷霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

1983年美國PE Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）[1]，該體外核酸擴(kuò)增技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，成為分子生物學(xué)、鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒和病菌感染必不可少的研究工具。1992年日本人Higuchi想實(shí)時(shí)觀察PCR反應(yīng)的全過程，最終達(dá)到檢測樣品中的DNA量的目的，最早提出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的設(shè)想[2,3]，繼而由1996年美國Applied Biosystems公司首先推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)都是依賴于產(chǎn)物的終點(diǎn)濃度進(jìn)行分析的，存在不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到局限，直到近年來熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技術(shù)用于PCR定量后，上述問題才得到較好的解決[4]，隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)明，此技術(shù)在不同研究領(lǐng)域都發(fā)揮出重要作用[5～8]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上把熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光標(biāo)記探針相結(jié)合，并巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測技術(shù)融合在一起的一項(xiàng)創(chuàng)造性技術(shù)，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，它具有實(shí)時(shí)性、快速、靈敏、高通量、特異性強(qiáng)、自動化程度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確定量等特點(diǎn)。

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不斷完善，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。由于該技術(shù)本身的優(yōu)越性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測、藥物療效考核、基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品安全等不同研究領(lǐng)域[9,10]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具[11～12]，而在植物害蟲研究上的報(bào)道相對其他領(lǐng)域較少，但是隨著最近幾年實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，有力地促進(jìn)了植物害蟲研究水平的提高，而且發(fā)揮著越來越重要的作用，已經(jīng)顯示出了極好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR概述

1.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理的基礎(chǔ)是熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（fluorescence resonance energy transfer, FRET），是指當(dāng)一個(gè)熒光分子（供體分子）的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光分子（受體分子）的吸收光譜相重疊時(shí)，且兩個(gè)集團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長熒光集團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個(gè)過程稱為FRET。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號的強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，利用熒光信號積累強(qiáng)度的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，最后在這一階段通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和Ct值。熒光閾值是指在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)，一般這個(gè)閾值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光基礎(chǔ)信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍，如果檢測到的熒光信號超過閾值才被認(rèn)為是可信的信號。而在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)被稱為Ct值，C代表循環(huán)（Cycle），T代表閾值（Threshold）[10]。對于Ct值與起始模板量關(guān)系的研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到該樣品的起始拷貝數(shù)[11]。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR相比，它具有諸多優(yōu)點(diǎn)：⑴ 定量原理獨(dú)特，用產(chǎn)生熒光信號的多少來顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)了動態(tài)實(shí)時(shí)連續(xù)熒光監(jiān)測，可視性強(qiáng)；⑵ 不需要PCR反應(yīng)后的處理，而且只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，大大降低了污染的可能性；⑶ 可以在很大濃度范圍內(nèi)(>10倍）進(jìn)行定量，有較高的靈敏度、特異性和精確性；⑷ 既可以做定性分析又可以做定量分析[13～14]。同時(shí)該技術(shù)也與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比還有其不足之處：⑴ 由于減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。⑵ 在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，由于沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品各不相同，致使試驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性；⑶ 試驗(yàn)成本太高，也限制了其的應(yīng)用范圍；⑷ 由于該技術(shù)極其靈敏，所以對實(shí)驗(yàn)操作的精確度要求較高。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類

根據(jù)熒光基團(tuán)標(biāo)記和實(shí)現(xiàn)能量共振轉(zhuǎn)移方式的不同，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用比較廣泛的為四大類，分別是熒光染料（SYBR Green）、水解探針（Tapman）、雜交探針、分子信標(biāo)，除此以外還有熒光標(biāo)記引物，復(fù)合探針法，Lighf-uP、Cyclicons、LUXt、Scorpion、Amplifluor等[15～17]。

2.1 熒光染料（SYBR Green）

SYBR Green是一種能與dsDNA特異結(jié)合的染料，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green，SYBR Green特異地與dsDNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號[18]。DNA結(jié)合染色的方法不需要使用特異性熒光標(biāo)記的探針，相對簡便，同時(shí)也降低了檢測的成本，其特異性完全由PCR的引物所決定。其主要不足是：染料與DNA雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的，它可以和反應(yīng)體系中所有DNA分子結(jié)合，易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的影響，產(chǎn)生熒光干擾，實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號，使定量結(jié)果不可靠。不過目前可以用熔解曲線分析來區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化對消除非特異性熒光也有很大幫助。

2.2 水解探針（Tapman）

目前在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中應(yīng)用較多的水解探針是Tapman探針。探針5’端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3’端一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），所以檢測不到該探針5’端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。在PCR擴(kuò)增過程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針的熒光基團(tuán)切下，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，不能發(fā)生FRET而產(chǎn)生熒光信號，每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)游離的熒光分子形成，可通過檢測系統(tǒng)觀察到信號的變化，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。利用標(biāo)準(zhǔn)品模板系列繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合各樣品的Ct值，可確定樣品的起初模板量[19]。美國ABI公司推出另外一種水解探針為Tapman-MGB探針，它與Taqman探針相比能更好地穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值[20]，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm值，簡化了探針的設(shè)計(jì)，更有益檢測單堿基突變。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是由于其長度短于Taqman探針，熒光和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，而使熒光背景更低。

2.3 雜交探針（Hybridization probe）

雜交探針技術(shù)主要是使用兩個(gè)特異的探針，其中上游的探針的3’端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，而下游的探針的5’端標(biāo)記有受體熒光基團(tuán)。在PCR模板退火階段，兩探針同時(shí)與目的基因發(fā)生頭尾結(jié)合形式的特異性結(jié)合，使供體和受體熒光基團(tuán)距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，但兩個(gè)探針結(jié)合于模板上影響擴(kuò)增效率。

2.4 分子信標(biāo)（Molecular beacons）

分子信標(biāo)技術(shù)是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，為一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針。在未與模板發(fā)生雜交前該探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，不發(fā)生熒光。當(dāng)該探針與模板雜交，使熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析[21]，若目標(biāo)DNA序列同分子信標(biāo)不能完全配對，雜交過程和信號不會出現(xiàn)。若在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中熒光標(biāo)記物不能緊靠淬滅基團(tuán)，會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景信號。若分子信標(biāo)內(nèi)雜交過強(qiáng)，會妨礙同目標(biāo)DNA分子的雜交，使得熒光信號不能充分釋放。最佳的分子信標(biāo)應(yīng)有合適的熔鏈特性。分子信標(biāo)可檢測單個(gè)核苷酸的突變，適于SNP分析和等位基因突變分析。但設(shè)計(jì)較難，既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號，又要避免莖部雜交過強(qiáng)，影響其與模板退火，從而影響熒光生成。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，有兩種定量模板的方法：絕對定量和相對定量。絕對定量指用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本量；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化[22]。

3.1 相對定量

相對定量指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。此方法與絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法基本相似，不同之處是未知樣品的量是相對于某個(gè)參照物的量而言。因此，相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。

3.2 絕對定量

絕對定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的量。此方法標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3 比較Ct法的相對定量

即△Ct值法，此方法是同時(shí)擴(kuò)增待測靶基因片段和一個(gè)作為內(nèi)參照的基因片段，一般是一個(gè)內(nèi)源性管家基因片段。通過測兩者的Ct值之差（△Ct），比較不同待測標(biāo)本DNA的△Ct值與正常標(biāo)本DNA的△Ct值的變化，可對未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物害蟲方面的應(yīng)用

目前，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)應(yīng)用于植物害蟲鑒定、防治等研究相對其他領(lǐng)域較少，但該技術(shù)在植物害蟲、植物病原線蟲和害螨研究中已經(jīng)顯示出了極好的應(yīng)用前景。

4.1 在植物害蟲鑒定及檢測研究中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的植物害蟲鑒定方法依賴于形態(tài)特征和寄主范圍等特征來區(qū)分，但是對于一些植物害蟲之間的區(qū)分比較困難，尤其是檢疫性植物害蟲實(shí)蠅類，薊馬類等，而實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是解決這一問題的可靠手段。余道堅(jiān)[23]應(yīng)用TaqMan探針和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分別建立了兩種快速鑒定重要檢疫性害蟲辣椒實(shí)蠅（Bactrocera latifrons）的方法。同時(shí)余道堅(jiān)等[24]還應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)，分別建立了SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定菲立濱實(shí)蠅（bactrocera philippinensis）和芒果實(shí)蠅（bactrocera occiptalis）的方法。實(shí)現(xiàn)了對檢疫性實(shí)蠅快速準(zhǔn)確的鑒定。徐浪等[25]應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，實(shí)現(xiàn)了對形態(tài)學(xué)方法很難鑒別的大洋臀紋粉蚧（Planococcus minor）和南洋臀紋粉蚧（Planococcus lilaciu）進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，從而達(dá)到快速鑒定檢疫性粉蚧的目的。K.Walsh等[26]利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲南黃薊馬（Thrips palmi）的方法。K.S.Huang等[27]也應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的方法。

另外，實(shí)時(shí)定量PCR還可以用來檢測土壤中的害蟲。KAREN HERBERT等[28]利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)，結(jié)合土壤DNA的提取，對土壤中葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae）若蟲進(jìn)行了檢測，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR在檢測土壤中植物害蟲和監(jiān)測種群動態(tài)變化方面具有很好的前景。

4.2 在植物害蟲生理研究中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物害蟲生理研究中也有很好應(yīng)用前景。崔旭紅等[29]利用TaqMan-MGB探針和特異性引物構(gòu)建了B型煙粉虱（Bemisia tabaci）hsp70實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測體系，對HSP70在B型煙粉虱抵抗高溫脅迫中的作用進(jìn)行研究。翟會芳等[30]也構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR體系，研究了HSP90在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲抗高溫中的作用。證明了該技術(shù)是研究植物害蟲抗逆性和相關(guān)基因表達(dá)的理想工具。Kanako Komaki等[31]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和熒光測定法對各蟲態(tài)豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌（Buchnera）的基因拷貝數(shù)進(jìn)行了研究，證明了該技術(shù)是研究植物害蟲體內(nèi)共生菌變化的靈敏工具。

4.3 在植物害蟲防治研究中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR植物害蟲防治研究中也有出色的表現(xiàn)。Lei等[32]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對酚氧化酶原-2（PxPPO2）在小菜蛾（Plutella xylostella）不同蟲態(tài)中的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行研究，可以通過降低PxPPO2的轉(zhuǎn)錄水平開發(fā)新型性殺蟲劑。張清平等[33]利用基于綠僵菌rDNA基因片段設(shè)計(jì)的PCR引物對、優(yōu)化的DNA制備方法以及熒光定量PCR技術(shù)，對早期東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）體內(nèi)的病原真菌DNA進(jìn)行簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，并確定病原真菌在其內(nèi)的增殖速率和動態(tài)變化。楊和平等[34]利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了甜菜夜蛾病毒殺蟲劑中甜菜夜蛾核型多角體病毒有效含量。證明了熒光定量PCR技術(shù)可以用于殺蟲劑有效生物含量的測定。James A.Anstead等[35]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了準(zhǔn)確檢測導(dǎo)致桃蚜（Myzus persicae）對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的兩個(gè)基因突變位點(diǎn)L1014F（kdr）和 M918T（super-kdr）。Y.P.Chen等[36]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對舞毒蛾（Lymantria dispar）被刻絨繭蜂（Glyptapanteles indiensis）寄生后不同時(shí)期不同組織中的GiPDV 1.1的表達(dá)量進(jìn)行檢測，證明該方法是一種可用于基因表達(dá)分析很好的工具。

4.4 在植物病原線蟲和螨類研究中的應(yīng)用

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也開始的應(yīng)用于植物病原線蟲和害螨的研究，并獲得很好的研究成果。王焱等[37]分別用特異性引物法、ITS-PCR-RFLP法和實(shí)時(shí)熒光PCR法對松材線蟲進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光PCR法耗時(shí)短，靈敏度高，適合用于松材線蟲的檢驗(yàn)檢疫。國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)均有報(bào)道了應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，不僅能快速、準(zhǔn)確的對松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）進(jìn)行鑒定，也能夠?qū)€蟲進(jìn)行定性和定量分析[38～41]。王明旭等[42]利用松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（B．mucronatus）的rDNA-ITS2種間差異顯著特性，設(shè)計(jì)TaqMan探針，用實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測方法能準(zhǔn)確地區(qū)別2種線蟲。Berry等[43]建立了爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica），玉米根腐線蟲（Pratylenchus zeae）和桑大型針線蟲（Xiphinema elongatum）的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測方法，對寄生甘蔗的三種線蟲實(shí)現(xiàn)了靈敏，準(zhǔn)確的檢測和定量。王翀等[44]設(shè)計(jì)鱗球莖莖線蟲（Ditylenchus dipsaci）特異的TaqMan 探針，建立了實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測方法。賀俊飛等[45]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測中華卵索線蟲（Ovomermis sinensis）體內(nèi)tra-1基因表達(dá)量，研究tra-1基因在中華卵索線蟲雌性生殖系統(tǒng)的發(fā)育、卵的形成以及胚胎的發(fā)育中的調(diào)控作用。Madani等[46]利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量，對馬鈴薯胞囊線蟲（Globodera pallida）以及甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）進(jìn)行檢測和定量。Zhang等[47]利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR定量檢測潛在植物寄生線蟲生防菌-洛斯里被毛孢子的種群密度，研究食線蟲真菌的DNA量和被寄生線蟲的百分比之間的關(guān)系，并可結(jié)合生物測定監(jiān)測土壤真菌的生物量和活性效果。李明等[48]運(yùn)用real-time PCR分析冷激和熱激后HSP70基因TCHSP70-4在朱砂葉螨體內(nèi)的表達(dá)量，對朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus（Boisduval））熱激蛋白HSP70的表達(dá)與其適應(yīng)高溫和低溫脅迫的關(guān)系進(jìn)行了研究。

5 小結(jié)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新的檢測方法，與常規(guī)RT-PCR相比具有明顯優(yōu)越的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和操作簡便的特點(diǎn)，但仍有些問題需解決，如自動化儀器﹑試劑及其檢測的成本等。近些年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于植物營養(yǎng)學(xué)研究、植物發(fā)育學(xué)研究、植物抗逆機(jī)理研究、轉(zhuǎn)基因植物的檢測、植物與微生物互作機(jī)理研究、植物抗病性檢測、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對植物基因表達(dá)的影響等方面[49]。在植物病蟲害研究的許多領(lǐng)域顯現(xiàn)出它的優(yōu)越性，并開始被廣泛應(yīng)用。

許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術(shù)進(jìn)行不斷深入的研究和改進(jìn)，使熒光PCR技術(shù)得到了進(jìn)一步的完善，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了許多新的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與生物基因芯片技術(shù)結(jié)合會使FQ-PCR技術(shù)進(jìn)一步完善，可提高其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍和普及程度，F(xiàn)Q-PCR將成為未來植物害蟲研究的必備工具，在植物保護(hù)領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。

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致謝：承蒙中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所馮潔研究員審閱、修改本文。