髓樣分化蛋白2對(duì)重癥急性胰腺炎的影響

孫 寧，葛春林

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110005)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌(G-)細(xì)胞壁的主要成分，它能被Toll樣受體4(TLR4)所識(shí)別，并且TLR4是LPS跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體。已有研究表明，TLR4的表達(dá)在發(fā)生胰腺炎的胰腺中存在上調(diào)趨勢(shì)，且急性壞死性胰腺炎時(shí)，肝、肺等組織中TLR4 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)［1］。所以，在SIRS和早期MODS，TLR4受體的激動(dòng)即可被認(rèn)為是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)失控的最初因素之一。本文主要就髓樣分化蛋白2(MD2)在TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要作用，及在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)的影響和臨床意義加以闡述。

1 MD2的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1999年，Miyake發(fā)現(xiàn)了一種能夠協(xié)同TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)——MD2，它由160個(gè)氨基酸組成，是一種分泌型糖蛋白，因?yàn)槠銷端有一段由16個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，使其具有分泌功能。除此之外，MD2還可以和TLR4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體結(jié)合，或直接可以表達(dá)于細(xì)胞表面，不僅能與TLR胞外區(qū)結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)，而且還能直接與LPS結(jié)合，引發(fā)炎癥反應(yīng)，是TLR4的重要輔助分子。

國內(nèi)外均有研究證明，MD2的氨基酸序列上有兩個(gè)糖基化結(jié)合位點(diǎn)，分別是Asn26和Asn114，雖然當(dāng)糖基化位點(diǎn)突變后，MD2仍可表達(dá)于細(xì)胞表面并與TLR4結(jié)合，但對(duì)于輔助TLR4引起的核因子κB(NF-κB)的活化功能卻明顯減弱，所以MD2糖基化位點(diǎn)突變的細(xì)胞在LPS刺激后只能引起細(xì)胞輕度的活化［2］。

2 MD2與TLR4、LPS的聯(lián)系

2.1 與TLR4、LPS的結(jié)合 有研究證明，MD2存在TLR4和LPS兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)合區(qū)，分別是C2末端的LPS結(jié)合區(qū)，N2末端的TLR4結(jié)合區(qū)［3］。在前者，MD2可以直接與LPS結(jié)合形成MD2-LPS復(fù)合體，再與TLR4結(jié)合，形成MD2-LPSTLR4復(fù)合體;在后者，MD2與TLR4結(jié)合形成MD2-TLR4復(fù)合體后，在CD14呈遞下，與LPS結(jié)合，形成MD2-TLR4-LPS復(fù)合體。這就說明:MD2可以直接與LPS結(jié)合，但如果TLR4要與LPS結(jié)合，則另需要先與MD2結(jié)合形成復(fù)合物并要經(jīng)過 CD14轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。

近年來的研究還發(fā)現(xiàn):MD2與TLR4的胞外區(qū)結(jié)合，定位于細(xì)胞表面，增加TLR4對(duì)LPS的反應(yīng)性并增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)調(diào)，然而僅轉(zhuǎn)染TLR4或是TLR4-CD14的細(xì)胞，均未發(fā)現(xiàn)TLR4與LPS結(jié)合［4］，另外，轉(zhuǎn)染了 TLR4基因的 HEK293細(xì)胞也不能被LPS-CD14激活，也不能引起NF-κB的活化。可是如果當(dāng)MD2-TLR4-CD14共同表達(dá)時(shí)，就能檢測(cè)到TLR4與LPS結(jié)合，同樣也發(fā)現(xiàn):當(dāng)轉(zhuǎn)染了MD2和 TLR4基因后的HEK293細(xì)胞在受到LPS-CD14刺激時(shí)出現(xiàn)NF-κB的活化［5］，活化后的NF-κB能夠引起前炎癥基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)大，最終造成胰腺持續(xù)壞死和多臟器功能障礙。

這些都說明了 TLR4不能與 LPS直接結(jié)合，MD2是TLR4必需的輔助因子，TLR4必須在MD2的參與和CD14的呈遞下，形成MD2-TLR4-CD14復(fù)合物后，才能進(jìn)一步形成MD2-LPS-TLR4復(fù)合物，從而介導(dǎo)免疫信號(hào)傳遞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

2.2 促進(jìn)TLR4的表達(dá) TLR4必須有MD2的幫助才能識(shí)別LPS，單獨(dú)轉(zhuǎn)染TLR4的HEK293細(xì)胞不能產(chǎn)生反應(yīng)，而合并有MD2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則顯示出很好的反應(yīng)性［6］，說明MD2能夠促進(jìn)TLR4的表達(dá)。MD2的基本功能之一就是與TLR4結(jié)合，形成MD2-TLR4，這種復(fù)合體為TLR4提供了足夠的結(jié)合位點(diǎn)，從而易化了TLR4的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且當(dāng)MD2與TLR4共同轉(zhuǎn)染時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)的TLR4能與聚合程度不同的MD2寡聚體形成特異性結(jié)合，多余的MD2分泌入血，在液相中仍然具有活性，使MD2可以產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)控作用［7］。

2.3 影響TLR4在細(xì)胞內(nèi)的分布 Nagai等研究發(fā)現(xiàn):MD2能夠影響TLR4在細(xì)胞內(nèi)的分布。將TLR4轉(zhuǎn)染至野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(EF)后，不僅在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，而且在細(xì)胞表面也有表達(dá);同時(shí)，對(duì)照將TLR4轉(zhuǎn)染至MD2基因缺如的小鼠EF，則只能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到TLR4的表達(dá)，細(xì)胞表面幾乎無TLR4表達(dá)。

2.4 對(duì)LPS信號(hào)的調(diào)控 已有大量研究證明，LPS能夠直接與MD2結(jié)合并發(fā)揮作用，而Hyakushima等［6］的研究也證明LPS不能與TLR4單獨(dú)結(jié)合，需要和細(xì)胞表面的MD2-TLR4復(fù)合體作用，盡管TLR4與LPS作用后，會(huì)發(fā)生配體依賴的聚合反應(yīng)，但是，這種配體依賴的TLR4低聚化和細(xì)胞表面MD2-LPS-TLR4復(fù)合物的形成幾乎同步，如果缺乏MD2，則這種低聚化就不能發(fā)生。

3 MD2在SAP中的表達(dá)與組織損傷

通過上述資料我們可以了解到，MD2除了能夠通過促進(jìn)TLR4的表達(dá)、促進(jìn)TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號(hào)而對(duì)SAP時(shí)釋放炎癥介質(zhì)產(chǎn)生重要影響外，在一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中，MD2能夠促進(jìn)NF-κB的活化，這也是影響SAP發(fā)生發(fā)展的另一重要因素。NF-κB是一類能與多種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、黏附分子基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)結(jié)合并增強(qiáng)這些基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。目前已有多數(shù)研究表明NF-κB參與了SAP的發(fā)病，那么通過抑制MD2參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從另一方面間接抑制NF-κB的活化，則也可以阻斷促炎因子的產(chǎn)生，對(duì)SAP起到治療和保護(hù)作用。

在正常情況下，機(jī)體能夠通過調(diào)節(jié)MD2的表達(dá)水平來調(diào)控LPS信號(hào)，但是如果機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)如TNF-α和(或)IFN-γ這些炎癥因子能夠刺激MD2表達(dá)上調(diào)時(shí)，LPS信號(hào)就可以通過TLR4-MD2復(fù)合體傳遞，活化NF-κB從而引起下游信號(hào)的瀑布反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，造成組織損傷和器官功能障礙。

由于胰腺炎早期主要的病理生理改變是胰腺組織的自身損傷，而這種無菌性炎癥首先激活機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)，并通過各種模式識(shí)別受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，活化單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)反應(yīng)，釋放比如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 等介質(zhì)，刺激 MD2 的表達(dá)上調(diào)。而當(dāng)病情不斷進(jìn)展至SAP時(shí)，胰腺組織開始由最初的充血、水腫發(fā)展至出血、壞死，進(jìn)而并發(fā)胰腺本身及周圍組織的感染(主要是G-菌感染)，啟動(dòng)特異免疫系統(tǒng)，再次刺激MD2的表達(dá)上調(diào)，機(jī)體分泌大量炎癥介質(zhì)，級(jí)聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)大。這些充分說明了MD2在SAP早期，甚至急性胰腺炎時(shí)，就已經(jīng)參與到這一系列抗感染免疫中，并發(fā)揮重要的作用。

4 阻斷MD2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)SAP的早期干預(yù)

既然MD2能夠通過促進(jìn)TLR4的表達(dá)、影響TLR4的分布以及促進(jìn)TLR4與LPS結(jié)合，活化NF-κB等輔助手段刺激機(jī)體免疫細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，那么，能否通過阻斷MD2的表達(dá)來預(yù)防或干預(yù)SAP的發(fā)生、發(fā)展呢?已有研究證明:能與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MD2的物質(zhì)能抑制LPS信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如可溶性的TLR4(sTLR4)、可溶性的MD2(sMD2)及LPS的類似物，均能達(dá)到抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放的目的，起到減輕炎癥的作用。

Rallabhandi等［8］研究了MD2的表達(dá)量對(duì)TLR4及LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中，隨著MD2轉(zhuǎn)染量的增加，TLR4的表達(dá)量也逐漸增加。而達(dá)到峰值后，繼續(xù)增加MD2劑量，TLR4的表達(dá)反而不再增加，NF-κB活性卻反而降低。說明一定量的MD2可促進(jìn)TLR4的表達(dá)，增強(qiáng)TLR4對(duì)LPS的敏感性，但過量的MD2和TLR4-MD2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS，從而生成MD2-LPS及MD2-TLR4-LPS兩種復(fù)合體，與單一復(fù)合體存在時(shí)相比MD2-LPS和MD2-TLR4-LPS的反應(yīng)性都很低，而這就在一定程度上抑制LPS信號(hào)激活。

另外，在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TLR4和MD2結(jié)合是重要的一步，可以通過阻止TLR4和MD2結(jié)合，達(dá)到阻止信號(hào)激活的目的。已有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的CD14(sCD14)，同樣能夠呈遞 MD2-TLR4與 LPS結(jié)合，形成 MD2-TLR4-sCD14-LPS復(fù)合體。但這種復(fù)合體不能激活正常的細(xì)胞反應(yīng)。所以若能增加sCD14的量，就能夠抑制細(xì)胞信號(hào)的激活，同樣可以起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。

5 未來研究方向

近年來國內(nèi)外對(duì)于SAP的研究多集中于如何在SAP發(fā)病早期即能對(duì)其進(jìn)行正確的判斷以及根據(jù)實(shí)際情況制定個(gè)體化治療方案，如基本的抗感染、抑制胰酶分泌，以及腹腔灌洗和(或)動(dòng)脈灌注療法、持續(xù)的血液透析濾過，甚至腹膜后引流、胰腺及其周圍壞死組織清除術(shù)等治療方案上。但是隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)于SAP在發(fā)生、發(fā)展及其發(fā)生機(jī)制特別是其病理生理變化再次成為人們關(guān)注的對(duì)象。所以，探究在SAP發(fā)生、發(fā)展、惡化這一系列環(huán)節(jié)中，到底有哪些細(xì)胞因子參與其中，發(fā)揮了什么作用，通過什么途徑發(fā)揮作用，通過什么干預(yù)可以終止這些反應(yīng)的傳導(dǎo)，進(jìn)而制定出在SAP早期即可以采取干預(yù)手段，就可以減少因?yàn)楦骨还嘞椿蚴莿?dòng)脈灌注、手術(shù)清創(chuàng)等有創(chuàng)性治療來給患者帶來的痛苦。

MD2的發(fā)現(xiàn)和其功能的研究，使我們逐步認(rèn)識(shí)到了它能輔助TLR4對(duì)LPS的識(shí)別。但是仍有許多問題值得我們進(jìn)行更深入的研究:對(duì)于LPS、TLR4和MD2三者之間更加深層的關(guān)系;為什么TLR4不能直接與LPS結(jié)合，而當(dāng)MD2與TLR4結(jié)合后，是通過改變TLR4的空間構(gòu)象還是利用自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其更易于與LPS-CD14結(jié)合;既然大量的MD2可以反過來抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，那么作為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，它究竟在SAP的哪一階段被啟動(dòng)等等。所以把MD2作為干預(yù)SAP早期炎癥反應(yīng)的靶點(diǎn)，可能會(huì)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，希望能夠通過抑制LPS信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少甚至抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而可以避免炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，達(dá)到干預(yù)SAP進(jìn)展惡化的目的。

［1］Zhang L，Wu HS，Chen Y，et al.Role of nitric oxide in Toll-like receptor 2 and 4 mRNA expression in liver of acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis rats ［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):485-488.

［2］Ohnishi T，Muroi M，Tanamoto K.N-linked glycosylations at Asn(26)and Asn(114)of human MD-2 are required for toll-like receptor 4-mediated activation of NF-kappaB by lipopolysaccharide［J］.J Immunol，2001，167(6):3354-3359.

［3］Prohinar P，Re F，Widstrom R，et al.Specific high affinity interactions of monomeric endotoxin.protein complexes with Toll-like receptor 4 ectodomain［J］.J Biol Chem，2007，282(2):1010-1017.

［4］Akashi S，Saitoh S，Wakabayashi Y，et al.Lipopolysaccharide interaction with cell surface Toll-like receptor 4-MD-2:higher affinity than that with MD-2 or CD14［J］.J Exp Med，2003，198(7):1035-1042.

［5］Kirschning CJ，Wesche H，Merrill Ayres T，et al.Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide［J］.J Exp Med，1998，188(11):2091-2097.

［6］Hyakushima N，Mitsuzawa H，Nishitani C，et al.Interaction of soluble form of recombinant extracellular TLR4 domain with MD-2 enables lipopolysaccharide binding and attenuates TLR4-mediated signaling［J］.J Immunol，2004，173(11):6949-6954.

［7］Gruber A，Mancek M，Wagner H，et al.Structural model of MD-2 and functional role of its basic amino acid clusters involved in cellular lipopolysaccharide recognition ［J］.J Biol Chem，2004，279(27):28475-28482.

［8］Rallabhandi P，Bell J，Boukhvalova MS，et al.Analysis of TLR4 polymorphic variants:new insights into TLR4/MD-2/CD14stoichiometry，structure，and signaling［J］.J Immunol，2006，177(1):322-332.