蠶絲絲素蛋白材料的生物降解性能研究進(jìn)展

徐亞梅，李明忠

(蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215021；現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲絲素蛋白材料的生物降解性能研究進(jìn)展

徐亞梅，李明忠

(蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215021；現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123)

絲素蛋白具有良好的生物相容性，但其用于制備組織工程支架等生物材料時(shí)，制成的材料還需具備的一個(gè)重要條件是其降解速率與組織新生的速率相匹配。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)絲素蛋白材料生物降解性能的研究進(jìn)展表明，影響材料降解性能的因素包括材料的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、植入點(diǎn)的機(jī)械和生理環(huán)境等。這些參數(shù)影響降解行為的具體過(guò)程和機(jī)理將是今后的研究重點(diǎn)。

蠶絲；絲素；生物材料；降解

生物醫(yī)用材料是用于對(duì)生物體進(jìn)行診斷、治療、修復(fù)或替換其病損組織及器官，或增進(jìn)其功能的新型高技術(shù)材料[1]。理想的生物醫(yī)用材料應(yīng)該不會(huì)引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)，有良好的生物相容性[2]。除此之外，在作為組織工程支架、藥物緩釋載體等應(yīng)用時(shí)，還應(yīng)可被生物降解、吸收或排出體外。

在可被降解的生物醫(yī)用材料中，絲素蛋白材料由于具有良好的透氧性、無(wú)毒性、無(wú)刺激性，以及良好的生物相容性受到了廣泛的關(guān)注[3]。家蠶絲素纖維臨床用作手術(shù)縫合線已近100年，而且近年來(lái)家蠶絲素蛋白材料也被用于人工皮膚、血管、角膜、功能性細(xì)胞培養(yǎng)載體、生物傳感器等生物醫(yī)用材料。這些研究結(jié)果表明絲素蛋白是作為生物醫(yī)用材料的重要可選原料。

蠶絲手術(shù)縫合線植入體內(nèi)2個(gè)月后，力學(xué)性能能保持50 %以上，根據(jù)美國(guó)藥典，它被界定為非降解性手術(shù)縫合線。但是后來(lái)的研究表明，絲素蛋白作為一種蛋白質(zhì)，可以被某些酶催化水解，并且在活體內(nèi)也會(huì)最終被吸收。被降解、吸收的速率與諸多因素有關(guān)，例如材料的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、植入點(diǎn)的機(jī)械和生理環(huán)境等[4]。

1 蠶絲絲素蛋白的組成與結(jié)構(gòu)

家蠶絲素由20種氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)含量大概占46 %，丙氨酸(Ala)約占29 %，絲氨酸(Ser)約為12 %。這些側(cè)基較小的氨基酸主要位于絲素蛋白的結(jié)晶區(qū)，而側(cè)基較大的氨基酸如苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)等則主要位于非晶區(qū)[5-6]。

絲素蛋白是由重鏈(H鏈，分子量350 kDa)、輕鏈(L鏈，分子量25.8 kDa)及糖蛋白P25(分子量23.55 kDa，另加3個(gè)寡糖鏈)組成，重鏈和輕鏈通過(guò)一個(gè)二硫鍵相連接，在絲素蛋白中以1∶1的比例存在，P25糖蛋白以非共價(jià)相互作用與重鏈和輕鏈連接[7]。

家蠶絲素的2種主要結(jié)晶結(jié)構(gòu)是silkⅠ和silkⅡ。silkⅠ呈曲柄形結(jié)構(gòu)，silkⅡ是反平行β-折疊結(jié)構(gòu)，silkⅠ結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)濕熱、極性溶劑等的處理會(huì)很容易地轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的silkⅡ結(jié)構(gòu)[4]。Regina等[8]發(fā)現(xiàn)了silkⅢ結(jié)構(gòu)，其肽鏈的構(gòu)象為β-折疊螺旋，存在于絲素溶液與空氣界面上。

在絲素的結(jié)晶區(qū)，結(jié)晶形態(tài)主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，肽鏈端排列較整齊，相鄰鏈段之間的氫鍵和分子間引力使它們結(jié)合得相當(dāng)緊密，抵抗外力拉伸的能力強(qiáng)，柔軟度低，在水中難以溶解，對(duì)酸、堿、鹽、酶及熱的抵抗力較強(qiáng)。在非結(jié)晶區(qū)絲素中鏈段的排列不整齊，鏈段之間的結(jié)合力較弱，在水中易溶脹，柔軟度高，抵抗外力拉伸的能力弱，吸濕性強(qiáng)，對(duì)酸、堿、鹽、酶和熱的抵抗力較弱[9]。

2 蠶絲絲素材料生物降解性能的早期研究

可降解生物材料是指在生理環(huán)境下發(fā)生分子量下降、分解或溶解的生物材料，其降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收或排出體外。高分子材料的生物降解并非單一機(jī)理，而是一個(gè)復(fù)雜的生物物理、生物化學(xué)協(xié)同作用，相互促進(jìn)的過(guò)程[10]。最早在20世紀(jì)60年代就有人為了研究絲素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，用α-胰凝乳蛋白酶將絲素纖維的無(wú)定形區(qū)水解，這說(shuō)明無(wú)定形結(jié)構(gòu)的絲素蛋白可以被蛋白酶降解[11-12]。Chen和Hirabayashi等[13-15]曾用糜蛋白酶、羧化酶等降解絲素纖維，將水解后的絲素用于食品添加劑和化妝品。這些早期的研究已基本能說(shuō)明絲素是可以被酶催化水解的。

3 蠶絲絲素材料的體外降解性能

具備良好的生物相容性是作為組織工程或組織誘導(dǎo)支架的一個(gè)必要前提，但還有關(guān)鍵的一點(diǎn)是材料的生物降解性能。材料的降解速率必須與組織的再生速率相匹配，并且滿(mǎn)足組織的功能需求[16]。因此，需要弄清絲素蛋白材料的生物可降解程度、降解機(jī)理及影響降解速率的因素。

Minoura等[17]研究了放線菌蛋白酶E對(duì)絲素纖維和50 %甲醇處理的絲素膜的降解作用，結(jié)果表明放線菌蛋白酶E能降解絲素膜，但對(duì)絲素纖維的作用不明顯。Arai等[18]用膠原蛋白酶IA、α-胰凝乳蛋白酶，放線菌蛋白酶XXI對(duì)絲素纖維和50 %甲醇處理的絲素膜進(jìn)行體外降解實(shí)驗(yàn)，降解17 d后，絲素纖維質(zhì)量沒(méi)有明顯變化，但斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率下降明顯；絲素膜質(zhì)量損失明顯，在放線菌蛋白酶XXI中損失最顯著，損失達(dá)60 %。對(duì)降解后膜的氨基酸組成分析表明，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，未被降解的殘留物中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸的相對(duì)含量增加，酪氨酸、纈氨酸或是極性或是帶有大的側(cè)鏈的氨基酸含量降低。甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸是組成絲素結(jié)晶區(qū)的主要氨基酸，而一些帶有大的或極性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸則主要分布于絲素的非晶區(qū)?？梢?jiàn)，酶降解是優(yōu)先作用于絲素膜的無(wú)定形區(qū)的。

Horan等[19]將蠶絲纖維并捻后脫膠，用放線菌蛋白酶XIV進(jìn)行體外降解，降解42 d后，質(zhì)量損失50 %以上，10周后，絲素纖維直徑減小至原來(lái)的66 %。對(duì)降解殘留物的檢測(cè)結(jié)果表明，絲素L鏈的相對(duì)含量減少、H鏈分子量下降。

Li等[20]將交聯(lián)劑加入絲素溶液后，采用冷凍干燥法制成絲素多孔材料，用膠原蛋白酶IA、α-胰凝乳蛋白酶、放線菌蛋白酶XIV體外降解。結(jié)果表明，在膠原蛋白酶IA溶液中降解后，殘留的絲素多孔材料中的silkⅡ結(jié)構(gòu)含量降低，形成了少量的silkⅠ結(jié)構(gòu)。在放線菌蛋白酶溶液中，經(jīng)降解后殘留的絲素多孔材料的結(jié)晶度有所提高。3種酶降解后，降解產(chǎn)物的平均分子量是放線菌蛋白酶XIV＜膠原蛋白酶IA＜α-胰凝乳蛋白酶。這說(shuō)明放線菌蛋白酶XIV對(duì)絲素蛋白的作用位點(diǎn)多，降解能力強(qiáng)。

Taddei等[21]對(duì)50 %甲醇處理的柞蠶絲素膜作體外降解研究表明，放線菌蛋白酶XXI能攻擊柞蠶絲素蛋白中的無(wú)定形區(qū)，而α-螺旋區(qū)則對(duì)酶的抵抗能力強(qiáng)。酶降解17 d后，柞蠶絲素膜質(zhì)量降低70 %。

以上對(duì)不同形態(tài)的絲素蛋白材料的降解行為的報(bào)道，研究了絲素蛋白材料的降解機(jī)理，進(jìn)一步證明了絲素蛋白材料能被降解。在此基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始研究影響絲素蛋白材料降解速率的因素，尋找調(diào)控其降解速率的方法。

絲素材料的降解程度與結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征(纖維，膜，多孔材料)[18]，以及催化其降解的酶種類(lèi)，也就是切割位點(diǎn)的專(zhuān)一性有關(guān)。絲素纖維因其高度的規(guī)整性和大量SilkⅡ結(jié)構(gòu)的存在而不易被降解，對(duì)于規(guī)整性相對(duì)較差的膜材料，酶更容易進(jìn)攻，所以較易被降解[22]。Kojthung等[23]研究了γ射線輻照對(duì)絲素纖維降解的影響，隨著輻照劑量加大，絲素纖維表面破損嚴(yán)重，纖維強(qiáng)力下降，在酶溶液中的降解沉淀物增多。這是因?yàn)棣蒙渚€輻照減少了絲素中的SilkⅡ結(jié)構(gòu)，使絲素的無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)增多，酶降解更容易，從而在降解產(chǎn)物中釋放出小分子量的蛋白質(zhì)。黃訓(xùn)亭[22]等研究發(fā)現(xiàn)，SilkⅡ結(jié)構(gòu)的含量能明顯地影響材料的降解速率，減少材料中SilkⅡ結(jié)構(gòu)的含量會(huì)大大加快材料的降解速率。因此，改變材料中SilkⅡ結(jié)構(gòu)的含量能夠有效地調(diào)節(jié)材料的降解速度。

Kim等[16]研究了完全水處理法(鹽瀝取法)和有機(jī)溶劑處理(HFIP)制得的絲素多孔材料的降解性能，水處理的多孔材料，絲素溶液濃度增大時(shí)，降解速率明顯減慢，但在1 U/5 mL線菌蛋白酶溶液中21 d后，材料都能完全降解，而用六氟異丙醇處理的多孔材料在20 U/5 mL溶液中21 d質(zhì)量?jī)H損失30 %?？梢?jiàn)改變絲素溶液的濃度或使用不同的處理方法都能改變絲素蛋白材料的降解速度。

共混也可以改變材料的降解速率。She等[24]研究了絲素/殼聚糖(SF/CS)共混多孔材料在PBS緩沖液中的降解，持續(xù)觀察了8周，發(fā)現(xiàn)SF/CS共混多孔材料能保持多孔結(jié)構(gòu)約6周，在前兩周質(zhì)量下降較快，2周后質(zhì)量損失13.18 %，而8周后質(zhì)量損失19.28 %。殼聚糖的質(zhì)量下降比絲素快。

絲素材料的降解速率還可以通過(guò)改變絲素的分子量分布來(lái)調(diào)節(jié)。改變絲素的分子量分布，可以在加熱的條件下用堿處理，或者用不同的鹽、不同的溫度溶解[25-26]。

4 蠶絲絲素材料的體內(nèi)降解性能

Bucknall等[27]用天然絲素纖維制成醫(yī)用手術(shù)縫合線，用于縫合腹部切口，10 d后，強(qiáng)力損失29 %，30 d損失73 %，70 d損失83 %。Greenwald等[28]將天然絲素纖維植入大鼠皮下6周后，強(qiáng)力損失55 %，彈性模量損失16 %。這些研究說(shuō)明絲素纖維可在生物體內(nèi)被降解。

Wang等[29]分別將鹽瀝取法和六氟異丙醇處理制得的絲素多孔材料植入大鼠皮下，研究觀察了1年，所有動(dòng)物的免疫反應(yīng)都輕微，大多數(shù)支架在2～6個(gè)月內(nèi)被完全降解。用六氟異丙醇處理制得的支架，組織生長(zhǎng)和降解都比鹽瀝取法制得的支架差，而且絲素溶液的濃度越高，組織向支架內(nèi)生長(zhǎng)就越少。結(jié)果表明，絲素支架在體內(nèi)的降解行為是可以預(yù)測(cè)的，從而可以對(duì)其調(diào)控，以滿(mǎn)足組織工程不同的需求。

為了進(jìn)一步研究絲素蛋白材料不同的形式和在不同的生理?xiàng)l件下的降解行為，Yang等[30]將絲素纖維和冷凍干燥法制成的絲素神經(jīng)導(dǎo)管植入兔的皮下，植入8周和12周后，絲素神經(jīng)導(dǎo)管質(zhì)量分別下降25 %和65.4 %，24周后質(zhì)量幾乎完全消失，而絲素纖維24周后質(zhì)量降解到65.7 %。HE染色表明，絲素神經(jīng)導(dǎo)管植入4周后，大量組織開(kāi)始向內(nèi)生長(zhǎng)，12周后材料完全浸潤(rùn)，大量的孔塌陷，到24周時(shí)材料碎裂，在一些植入點(diǎn)已經(jīng)找不到材料的碎片了。而絲素纖維，在24周時(shí)還保持著完整的結(jié)構(gòu)。

5 展 望

蠶絲絲素蛋白料作為生物醫(yī)用材料的優(yōu)異性能和巨大潛力引起了國(guó)內(nèi)外生物材料界的極大關(guān)注。而生物降解性是作為醫(yī)用組織再生支架的一個(gè)必要條件，無(wú)論是在體外還是體內(nèi)完成組織的再生，材料的降解速率應(yīng)與組織的再生速率相匹配。

近年來(lái)的研究表明，影響材料降解性能的因素有很多，如材料的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、植入點(diǎn)的機(jī)械和生理環(huán)境等[4]。但是，這些參數(shù)影響降解行為的具體過(guò)程和機(jī)理還不太清楚。因此，需要進(jìn)行深入的研究，弄清楚絲素材料的降解過(guò)程和機(jī)理及影響因素，只有這樣才能有效地調(diào)控絲素蛋白材料的降解速率，滿(mǎn)足組織工程對(duì)支架材料的要求。

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Research progress of biodegradation properties of silkworm silk fibroin materials

XU Ya-mei, LI Ming-zhong
(College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215021, China; National Engineering Laboratory for Modern Silk,Suzhou 215123, China)

Silk fibroin has good biocompatibility. However, being used as tissue engineering scaffold, one of the key factors should be considered, which is the biodegradation rate of the silk fi broin should match the formation speed of a new tissue. This article reviewed the research development of biodegradation properties of silk fibroin biomaterials at home and abroad in recent years. The results show that influence factors of materials degradation performance include material form, structure, mechanical and physiology environment of the implant point, etc. The detailed process and mechanism of degradation behavior influenced by these parameters will be the research emphasis in the future.

Silkworm silk; Silk fibroin; Biomaterial; Degradation

TS149

A

1001-7003(2011)05-0019-04

2010-12-31；

2011-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970714)；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(BK2010252)

徐亞梅(1985－ )，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榻z蛋白生物材料及紡織功能材料。通訊作者：李明忠，教授，博導(dǎo)，mzli@suda.edu.cn。