10味中草藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗

（長江大學動物科學學院，湖北 荊州434025）

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus）可引起多種畜禽疫病，臨床最常見的有敗血癥、關節(jié)炎、乳房炎、皮膚、組織器官化膿性感染及蜂窩織炎等。雞金黃色葡萄球菌性關節(jié)炎是雞葡萄球菌病中常見的一種。雞、鴨常因趾、蹼或腿部被鐵絲、碎玻璃等雜物劃傷而感染金黃色葡萄球菌[1]，從而導致關節(jié)腫大、跛行，行走困難，采食和飲水受到極大影響，病雞逐漸消瘦、脫水，最終死亡。該病是一種條件性、環(huán)境性疾病，對肉雞育成期的影響極大，?？捎纱藥砭薮蟮慕?jīng)濟損失。

目前，臨床上主要還是使用抗菌藥物來控制雞金黃色葡萄球菌病，但由于廣泛、大量、長期不規(guī)范地使用抗生素而導致該菌的耐藥性大幅度提高，防治效果越來越差，并導致藥物殘留和一些藥源性疾病，嚴重威脅著食肉安全[2]。近年來，國內外研究者在科學實驗和生產實踐中，運用中獸醫(yī)學理論，開發(fā)利用中藥資源，取得了一定的成績。中草藥對病原菌的體外抑菌試驗陸續(xù)有研究報道[3]。為了全面了解中草藥對畜禽金黃色葡萄球菌的抗菌效果，筆者選用10味中藥單方對從患病雞病料中分離鑒定的金黃色葡萄球菌進行了體外抗菌試驗，旨在了解這些中藥的抗菌效果，為該病的臨床用藥及研制開發(fā)中草藥方劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試中草藥及單味藥液的制備

中草藥金蕎麥、黃連、連翹、大青葉、菊花、金銀花、蒲公英、板藍根、魚腥草、紫蘇等購自湖北省荊州市弘衛(wèi)大藥房。

將以上10種中草藥分別稱取100g，加水1～2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文火煎30min，過濾，藥渣再加水0.5～1L，按上述方法進行再次操作后過濾。合并2次濾液，用文火濃縮至100ml，即認為藥液中生藥的含量為1g／ml。高壓滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株為由某種雞場自然患關節(jié)炎病雞的關節(jié)腔內分離，經(jīng)純化、鑒定后保存的金黃色葡萄球菌菌株。按常規(guī)方法配制牛肉湯和普通瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的復蘇與純化

供試菌株臨用前經(jīng)高鹽甘露醇瓊脂2次純化培養(yǎng)后，接入營養(yǎng)瓊脂內培養(yǎng)24h，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養(yǎng)。用滅菌的生理鹽水將菌苔洗脫下來，采用平板表面涂布法計數(shù)并稀釋至濃度為109cfu／ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的測定

無菌條件下將涂布有菌懸液的基礎培養(yǎng)基平板等間距對稱地用外徑6mm的硬塑料管打4個孔，挑出孔中培養(yǎng)基，并在酒精燈火焰上對培養(yǎng)平板封底，將各種供試中草藥用蒸餾水按2倍稀釋法稀釋成1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625g／ml 5個濃度，吸取藥液50μl加入孔中，每種中草藥每個濃度設3個重復，然后將培養(yǎng)平板放入37℃溫箱培養(yǎng)24h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑，同種中草藥同一濃度取其抑菌圈直徑的平均值，此即各種中草藥在不同濃度下對供試菌株的抑菌圈直徑[4]。

參考NCCLS推薦的標準進行判斷[4]。以抑菌圈直徑＞20mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～14mm之間為中敏，抑菌圈直徑＜14mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

1.2.3 供試中草藥對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

采用試管兩倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC）。本法是用培養(yǎng)基將藥物按兩倍遞減稀釋法稀釋成系列濃度，依次分裝在一系列的容器中，于各容器內加入對該藥敏感的試驗菌，經(jīng)過一定時間和溫度的培養(yǎng)，觀察各容器中試驗菌生長狀況而得出藥物的最低抑菌濃度。

將按1.1方法制備的供試中草藥的單味藥液(生藥含量為1g／ml）用普通肉湯培養(yǎng)基稀釋5倍后（即藥液濃度為200mg／ml），再按倍比稀釋法稀釋至29共10個稀釋度。第1管至第9管藥物濃度（mg／ml）分別為200×20、200×2-1、200×2-2、200×2-3、200×2-4、200×2-5、200×2-6、200×2-7、200×2-8。然后將上述盛有含藥培養(yǎng)基的試管在121℃下高壓滅菌30min，冷卻，備用。將試驗菌接種于基礎培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)18h，然后用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，制成菌懸液，控制其濃度為109cfu／ml。吸取20μL的菌懸液于1～10管不同濃度的含藥培養(yǎng)基中，11和12管分別為不加中草藥液的陽性對照和加藥液不加菌懸液的陰性對照，搖勻后置于37℃的恒溫箱中孵育20h，觀察細菌生長情況，每種藥物設2個平行[3]。

判定標準：首先在觀察陽性對照管長菌呈渾濁狀，而陰性對照管不長菌、呈透明狀的前提下，再觀察其他試管的渾濁情況，以判斷不同濃度藥液的抑菌作用，如試管內呈渾濁，證明有細菌生長，用“＋”表示；如試管內澄清透明，證明無菌生長，用 “-”表示。以眼觀不渾濁試管的最低藥物濃度作為該藥的MIC；若藥液色素太深，從中取一環(huán)接種于普通培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后再進行觀察[3]。

1.2.4 最低殺菌濃度(MBC）的測定

自上述各管中挑取培養(yǎng)液1環(huán)，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h后觀察結果。凡在相應培養(yǎng)皿上無金黃色葡萄球菌生長者，表明細菌被藥物殺死，以無菌生長的最高藥物稀釋度為該藥對供試菌株的MBC[3]。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)、染色特征

供試菌株在普通瓊脂平板上均長出表面濕潤、光滑、圓形隆起、粘稠不易挑起的小菌落，菌落的顏色為金黃色、黃白色或檸檬色不等，直徑1～2mm，有的可達4～5mm。涂片、染色、鏡檢后發(fā)現(xiàn)光鏡下均為革蘭氏陽性小球菌，成對、短鏈狀或呈葡萄串狀排列，鏈的長短不一，形狀各異。

2.2 供試中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

10種中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見表1。由表1可知，所選的10種中草藥中，黃連的抑菌效果最好，在稀釋濃度為0.125～1.00g／ml之間時均顯示極敏，在稀釋濃度為0.0625g／ml時其抑菌圈直徑為18mm(高敏）。其次是大青葉，在稀釋濃度為1.00g／ml時其抑菌圈直徑為21mm(極敏）。抑菌效果最差的是板藍根，在試驗設定的稀釋濃度下沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈。

表1 10味中草藥對1株雞源性金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.3 供試中草藥對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

本試驗所選用的10種中草藥對臨床分離的金黃色葡萄球菌的體外抗菌試驗結果MIC和MBC分別見表2和表3。由表2可知，所選的10種中草藥中，對臨床分離的金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯的是黃連、連翹和大青葉，其MIC均為12.5，其次是菊花，而板藍根的抑菌效果最差，在試驗設定的濃度下沒有出現(xiàn)明顯的抑菌效果。

表2 10味中草藥對1株雞源性金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度

由表3可知，所選的10種中草藥中，對臨床分離的金黃色葡萄球菌的殺菌效果最明顯的是黃連，其MBC為12.5，其次是大青葉，其MBC為50.0。而金銀花、板藍根、魚腥草、蘇紫這4種中草藥在試驗設定的濃度下無明顯的殺菌效果。

表3 10味中草藥對1株雞源性金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度

3 討論與小結

中草藥作為我國的優(yōu)勢國藥，具有抗菌、消炎、不易產生耐藥性、低毒、低殘留、可增強機體免疫力等特點，受到了廣泛的關注，而且我國中草藥資源豐富、品種齊全，而且毒副作用小、價格較低、加工方便，因此，研究中草藥的抑菌效果及抑菌機理具有積極的臨床意義。

近年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)一些中草藥具有良好的抗金黃色葡萄球菌作用。胡芳等[5]用試管稀釋法測定幾種抗生素單用及與雙黃連伍用對細菌的體外最低抑菌濃度(MIC），結果顯示，雙黃連粉針與青霉素、頭孢唑啉及紅霉素配伍后對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果明顯增強。何顯忠等[6]報道金銀花能抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖、降低金黃色葡萄球菌感染小鼠的死亡率。本研究選用金蕎麥、黃連、連翹、大青葉、菊花、金銀花、蒲公英、板藍根、魚腥草、紫蘇這10種常用中草藥為試驗材料，對臨床分離的金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果進行研究。結果表明，黃連、大青葉和連翹的抑菌效果較好。由此提示，在臨床用藥中可選擇這3種中草藥作為首選藥進行配伍組方來預防和輔助治療雞金黃色葡萄球菌病。

本試驗僅做了中草藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，但藥物進入動物體內后能否達到積極的抑菌效果，有待于進一步的動物試驗加以驗證。

[1]陳燕麗，茵梔黃注射液抗金黃色葡萄球菌作用及機理研究 [D].重慶：西南大學，2007.

[2]郎利敏，王克領，張立憲，等.10味中藥對畜禽大腸桿菌的體外抗菌活性試驗 [J].中獸醫(yī)學雜志，2011，3：6-8.

[3]王德海，程國富 .10種中草藥對金黃色葡萄球菌的體外抗菌試驗 [J].動物醫(yī)學進展，2005，26（6）：95-98.

[4]程國富，王德海，谷長勤，等.45種藥物對雞關節(jié)源性金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果 [J].動物醫(yī)學進展，2004，25（6）：87-89.

[5]胡 芳，呂麗艷，劉伯陽 .雙黃連粉針與幾種抗生素伍用的體外最低抑菌濃度研究 [J].中國藥業(yè)，2003，（2）：51.

[6]何顯忠，蘭榮德 .金銀花的藥理作用與臨床應用 [J].時珍國醫(yī)國藥，2004，15（12）：865-867.